Estudio de la regulación de los sistemas implicados en la absorción y translocación de potasio en Arabidopsis thaliana L. y Solanum lycopersicum L

Abstract

OBJECTIVOS

El objetivo fundamental de esta Tesis Doctoral ha sido profundizar en el conocimiento de los sistemas de absorción de potasio (K+) en las plantas mediante el estudio de los procesos fisiológicos y mecanismos moleculares implicados en la misma, en la especie modelo Arabidopsis thaliana y en la especie de interés agronómico Solanum lycopersicum. En este contexto, se han abordado los siguientes objetivos específicos: 1- Estudio del efecto de la deficiencia de nitrato (NO3-), fosfato (PO43-) o sulfato (SO42-) sobre la adquisición y translocación de K+, en plantas de Arabidopsis y tomate, en el rango de alta y baja afinidad.

2- Estudio de los mecanismos implicados en la regulación transcripcional/postranscripcional del transportador de alta afinidad HAK5 en respuesta a la deficiencia de K+ en las plantas de Arabidopsis y tomate.

3- Estudio de la influencia de la presencia de cesio (Cs+) sobre la absorción de K+ e identificación de sistemas implicados en la absorción de Cs+ en las plantas de tomate.

4- Estudio transcriptómico de plantas de tomate sometidas a ayuno de K+.

METODOLOGÍA

Para la consecución de los objetivos planteados se ha recurrido a distintos tipos de material biológico, y a numerosas técnicas de fisiología vegetal y biología molecular, resumidas a continuación:

1. Material biológico y condiciones de crecimiento:

Las bacterias (Escherichia coli y Agrobacterium tumefaciens), levaduras (Saccharomyces cerevisiae) y plantas (A. thaliana, S. lycopersicum y Nicotiana benthamiana), se crecieron en los medios y condiciones adecuados en cada caso.

2. Métodos:

-Determinación de la capacidad de absorción de K+/Cs+ y contenido mineral interno en las plantas. -Métodos de cruzamiento y transformación de plantas de Arabidopsis. -Manipulación de ácidos nucleicos y proteínas. -Ensayo de RNA-seq.

CONCLUSIONES

1. Las deficiencias de nitrato, fosfato o sulfato reducen la absorción de K+ en el rango de baja afinidad en Arabidopsis y tomate, y también disminuyen su translocación de raíz a parte aérea. En el rango de alta afinidad, la deficiencia de NO3-, PO43- o SO42- inducen la transcripción del gen HAK5 pero únicamente se produce la activación del transportador cuando hay deficiencia de K+, tanto en Arabidopsis como en plantas de tomate.

2. La presencia de altos niveles de calcio (Ca2+) en el medio externo revierten la represión de la absorción de K+ de alta afinidad ocasionada por la presencia de sodio (Na+) en plantas de tomate.

3. El etileno y las especies reactivas de oxígeno (ROS) participan en la vía de señalización de la respuesta a la deficiencia de K+, en raíces de plantas de tomate.

4. El transportador de alta afinidad de Arabidopsis, AtHAK5, se regula a nivel postranscripcional mediante un mecanismo de fosforilación por el complejo AtCIPK23/CBL1. El dominio C-terminal de AtHAK5 parece estar implicado en los mecanismos de regulación postraduccional. La formación de multímeros de AtHAK5 podría constituir otro mecanismo de regulación postraduccional del transportador. Los aminoácidos G, Y, G, D presentes en el dominio N-terminal de AtHAK5 constituyen residuos imprescindibles para su función.

5. Cuando el Cs+ está presente en el medio externo a concentraciones milimolares es absorbido por las plantas de tomate mediante un sistema de transporte sensible a Ca2+; mientras que cuando está presente a concentraciones micromolares y en condiciones de bajas concentraciones externas de K+, su absorción parece ser mediada por el transportador de K+ de alta afinidad, SlHAK5.

6. El análisis transcriptómico realizado en raíces de plantas de tomate ayunadas de K+, revela elementos comunes con la vía de señalización de la deficiencia de K+ descrita en Arabidopsis, así como elementos que parecen específicos de tomate. En la raíz, parte aérea y fruto de las plantas de tomate se han identificado transcritos cuya expresión se modifica en más de una parte de la planta en respuesta a ayuno de K+, indicando su importancia en la señalización por bajo K+ en la planta.

OBJECTIVES

The main objective of this Doctoral Thesis has been gaining insights into the systems involved in potassium (K+) absorption in plants and their regulatory mechanisms, by taking physiological and genetics approaches. The model plant Arabidopsis was used in order to advance in the knowledge of K+ uptake and its regulation. Tomato plants were also used because of the importance of identifying such mechanisms in relevant crops. In this context, the specific objectives were: 1- Study the effects of nitrate (NO3-), phosphate (PO43-) or sulfate (SO42-) nutrition on K+ uptake and its translocation, in Arabidopsis and tomato plants, in the millimolar and micromolar range.

2- Study of transcriptional and posttranscriptional mechanisms involved in HAK5 regulation in response to K+ deprivation.

3- Characterization of cesium (Cs+) absorption by tomato roots.

4- Transcriptome analysis of tomato plants in response to K+ deprivation by an RNA-seq approach.

METHODOLOGY

1- Material and growth conditions:

Bacterial strains (Escherichia coli y Agrobacterium tumefaciens), yeast strains (Saccharomyces cerevisiae) and plants (A. thaliana, S. lycopersicum and Nicotiana benthamiana), were grown on specific mediums and subjected to treatments as indicated in each case.

2- Experiments/assays:

-K+/Cs+ depletion and uptake experiments and mineral composition determinations of plant tissues. -Crossing and transformation of different Arabidopsis lines. -Nucleic acids and proteins manipulation. -RNA-sequencing assay.

CONCLUSIONS

1. NO3-, PO43- or SO42- deficiency reduces low-affinity K+ uptake capacity of Arabidopsis and tomato plants, and it also results in a decreased translocation of K+ to the shoot in both Arabidopsis and tomato plants. In the micromolar range, these deficiencies induce HAK5 transcription but only K+ deprivation produces functional HAK5-mediated K+ uptake by Arabidopsis and tomato roots.

2. High Ca2+ reverts the repression of high-affinity K+ uptake produced by Na+ in tomato plants.

3. Ethylene and ROS play an important role in plant responses to K+ deficiency in tomato roots.

4. The high-affinity K+ transporter AtHAK5 is regulated at the posttranslational level by phosphorylation in its N-terminus domain by the AtCIPK23/CBL1 complex. The C-terminus domain of AtHAK5 seems to be involved in posttranslational regulation. Another posttranslational regulation of AtHAK5 could involve multimerization of AtHAK5. The G,Y,G,D residues present in the N-terminus domain of AtHAK5 are individually essential for its functionality at low K+ concentrations and could be shaping the pore region responsible for K+ ion binding.

5. When Cs+ is present at high concentrations it is absorbed through a Ca2+-sensitive pathway; while at when present at micromolar concentrations, Cs+ is taken up probably by the SlHAK5 transporter in K+-starved tomato plants.

6. The transcriptome analysis of tomato plants reveals common elements between Arabidopsis and tomato plants in the low-K+ signaling pathway, as well as tomato-specific elements. The K+-starved root, shoot and fruit show differentially expressed transcripts that could be further studied.