Síntesis y desarrollo de nuevos metalofármacos basados en ligandos benzimidazol con actividad terapéutica frente al cáncer y el alzheimer

Abstract

La finalidad de este trabajo ha sido el diseño de nuevos metalofármacos basados en benzimidazol, así como el estudio de su mecanismo de acción. La Tesis consta de 8 capítulos entre los que se incluye una introducción general y unas conclusiones finales. La metodología de trabajo para los complejos antitumorales se basa en cuatro etapas claramente diferenciadas. En primer lugar, se lleva a cabo el diseño y la síntesis de los compuestos, los cuales son caracterizados por espectrometría de masas, análisis elemental, espectroscopia de RMN y difracción de rayos X. En un segundo paso, se estudia su estabilidad por RMN, RP-HPLC o espectroscopia de absorción en condiciones pseudofisiológicas. A continuación se evalúa la actividad antitumoral en distintas líneas tumorales humanas, habitualmente de carcinoma de ovario humano sensible (A2780) y resistente a cisplatino (A2780cisR). Por último, se verifica si el mecanismo de acción encaja con aquello para lo cual fue diseñado el fármaco. En algunos casos se realizaron además cálculos teóricos QC sobre compuestos modelo basados en rutenio. El capítulo 2 abarca el diseño, síntesis y propiedades antitumorales de nuevos compuestos organometálicos semi-sandwich C^N ciclometalados [(η6-p-cymene)RuCl(κ2-N,C-L)], [(η5-C5Me5)IrCl(κ2-N,C-L)] and [(η5-C5Me5)RhCl(κ2-N,C-L)] con ligandos C^N = 1-butil-2-fenil-benzimidazol-5-carboxilato de metilo. El enlace al N (R1) del imidazol permite introducir diferentes funciones con diversa capacidad hidrofóbica. Asimismo, el grupo carboxilato puede servir como puerta para la funcionalización de los metalofármacos. El ligando 2-fenil-benzimidazol se puede preparar a partir del correspondiente derivado de ácido benzoico disponible comercialmente mediante cuatro etapas, usando para ello reacciones de esterificación (i), sustitución aromática (ii), reducción (iii) y condensación (iv). La síntesis de este ligando polivalente es completamente innovadora. Dada la interesante actividad biológica mostrada por los compuestos C^N ciclometalados descritos anteriormente, en el capítulo 3 nos planteamos investigar la posible influencia de los efectos electrónicos del ligando 2-fenil-benzimidazol. Con esta idea, se ha diseñado la síntesis de nuevos complejos con 2-fenil-benzimidazol en los que el anillo fenilo se modifica con distintos sustituyentes para la realización de un estudio de la relación estructura-actividad (SAR) de los complejos de Ru y sus análogos de Ir y Os. Para ello se utilizaron distintos sustituyentes dadores y aceptores electrónicos en la posición 4 del anillo fenilo del ligando 2-aril-benzimidazol quelato (R = CF3, F, CH3, OMe, NO2 o Ph). Los nuevos compuestos son capaces de vencer la resistencia adquirida en las células A2780cisR y para el caso de los complejos de Ru(II) y de Ir(III) mostraron, además, capacidad para inhibir la formación de tubos en la línea endotelial EA.hy926 a concentraciones sub-citotóxicas (0,5 µM). En el capítulo 4 se describe el efecto de la modificación de la aromaticidad del ligando C^N benzimidazol en complejos semi-sándwich de Ru(II), Ir(III) y Os(III). Por otro lado, la aromaticidad heterocíclica producida por la contribución extra de un hetero-átomo se ha estudiado mediante la selección del benzo[b]tiofen-2-il como el grupo aromático unido al benzimidazol. El capítulo 5 se ha dedicado a la síntesis de una librería de nuevos complejos heterolépticos luminiscentes de Ir(III) del tipo [Ir(C^N)2(N^N)]+ como posibles agentes teranósticos. Los ligandos N^N utilizados fueron: 2,2'-bipiridina, 1,10-fenantrolina y 2-(piridin-2-il)-1H-benzo[d]imidazol y los nuevos ligandos benzimidazol-5-carboxilato de metilo que contienen una función éster. En general los nuevos compuestos monómeros bis-ciclometalados con ligandos benzimidazol con un grupo butilo sobre el N mostraron una alta citotoxicidad (en el intervalo nanomolar) en las células A2780 (algunos resultaron aproximadamente 7 veces más citotóxicos que cisplatino), y además, resultaron muy activos frente a las líneas celulares tumorales de mama MDA-MB-231 (aproximadamente 100 veces más citotóxicos que cisplatino en muchos casos) y MCF-7, mientras que la mayoría de ellos mostraron baja citotoxicidad en células no tumorales BGM. El capítulo 6 se dedicó a la preparación de complejos ciclometalados de Ir(III) con ligandos benzimidazol funcionalizados con grupos tales como la dopamina y el fluoróforo dansilo, junto a derivados pegilados (o unión de un PEG). En el capítulo 7 se planteó la utilización de ligandos tipo N^N 2-piridil-benzimidazol para la síntesis de compuestos metálicos quelato como posibles inhibidores de la agregación Aβ y como potenciales agentes terapéuticos de la enfermedad de Alzheimer. Por último, se demostró que uno de los compuestos de iridio actúa como un neuroprotector. Así, a una concentración 10 µM, es capaz de impedir la muerte neuronal que es provocada por el Aβ en un cultivo primario de neuronas corticales.

The aim of this work has been the design of new precious metal-based drugs containing benzimidazole-based ligands with a handle for functionalization. The work methodology is divided in four different steps. First of all, we design and synthesize the new compounds, which are characterized by mass spectrometry, elemental analysis, NMR spectroscopy and X-ray diffraction. Secondly, their stability in DMSO and pseudo-physiological conditions is studied by NMR, RP-HPLC or absorption spectroscopy. Next, their antitumor activity is evaluated in different human cancer cell lines; sensitive (A2780) and cisplatin resistant (A2780cisR) ovarian carcinoma cells are commonly employed. Finally, their mechanisms of action were studied. In addition, theoretical calculations QC were undertaken in the case of some ruthenium models. In Chapter 2 smart design and efficient synthesis of half-sandwich benzimidazole Ru(II), Ir(III) and Rh(III) cyclometalated complexes with an ester as a handle for functionalization of the types [(η6-p-cymene)RuCl(κ2-N,C-L)], [(η5-C5Me5)IrCl(κ2-N,C-L)] and [(η5-C5Me5)RhCl(κ2-N,C-L)] (HL = methyl 1-alkyl-2-phenylbenzimidazolecarboxylate) are reported with promising cytotoxic activity. In Chapter 3 butyl substituent on benzimidazole metal compounds was used for further structure-activity relationship SAR study. It described divergent synthesis of novel C^N cyclometalated benzimidazole ruthenium(II), osmium(II) and iridium(III). Phenyl ring on benzimidazole was most derivatized by different substituent like electron donating substituents (OCH3), electron withdrawing substituents (NO2), aromatic substituents (Ph), neutral substituents (H, CH3) as well as fluoro substituent (F, CF3) of benzimidazole ruthenium as well as analogues of iridium and osmium complexes. The cytotoxic activity of the new Ru(II), Os(II) and Ir(III) compounds has been evaluated in a panel of human cancer cell lines in order to establish a SAR in these families of compounds. Phenyl substitution shows increased potency in Ru, Os and Ir complexes as compared to their parent compounds in all cell lines. In general, ruthenium complexes are more active than the corresponding iridium complexes. In addition, some of the metal complexes effectively inhibit angiogenesis in the human umbilical vein endothelial cell line EA.hy926, with the ruthenium derivatives with R2 = Ph and CF3 substituents being the best performers. In order to study the effect of aromaticity on the activity of the above complexes we have succeeded in chapter 4 on the synthesis of methyl 1-butyl-2-(naphthalen-2-yl)-1H-benzo[d]imidazole-5-carboxylate ruthenium, iridium and osmium derivatives, together with the 1-butyl-2-(pyren-1-yl)-1H-benzo[d]imidazole-5-carboxylate iridium and osmium derivatives. The heterocyclic aromaticity with extra contribution from hetero-atom was studied by selecting benzo[b]thiophen-2-yl as an aromatic partner with benzimidazole. The C^N cyclometalated benzimidazole linked to the benzothiophene Ru(II), Ir(III), and Os(II) compounds were synthesized. In chapter 5 we synthesized fifteen luminiscent heteroleptic Ir(III) antitumor agents of the type [Ir(C^N)2(N^N)][PF6]. The different N^N ligands were 2,2'-bipyridine, 1,10-phenanthroline, 2-(pyridin-2-yl)-1H-benzo[d]imidazole, methyl 1-butyl-2-(pyridin-2-yl)-1H-benzo[d]imidazole-5-carboxylate, and methyl 1-butyl-2-(isoquinolin-3-yl)-1H-benzo[d]imidazole-5-carboxylate. The new compounds show very high cytotoxicity in A2780 cells (81 and 86 being approximately 7x more cytotoxic than CDDP), and, interestingly, they are also very active towards the breast tumor cell lines MDA-MB-231 (approximately 100x more cytotoxic than CDDP in many cases), and MCF-7, while most of them show low toxicity in the non-tumorigenic BGM cells. According to confocal luminiscence imaging studies they were located in the actin cortex predominantly. These preliminary results have the potential to open up the door to a new large family of theranostic agents. We successfully synthesized in chapter 6 the Ir(III) compounds with short linear polyethylene glycol (PEG) linkers for conjugation to improve the lipophilicity and cytotoxicity. Moreover, benzimidazole Ir(III) complex functionalized with a dansyl fluorescence tag was efficiently synthesised for its cellular internalization studies. On the other hand, the synthesis of bis-cyclometalated C^N iridium(III) compounds functionalized with a dopamine group to make efficent and effective drugs. In chapter 7 we have effectively synthesised half-sandwich benzimidazole N^N precious metal complexes. 2-pyridyl-benzimidazole Ru, Ir and Pt compounds have already shown that they inhibit aggregation of Aβ1-42 in vitro as shown by both thioflavin T fluorescence assay and transmission electron microscopy. An iridium complex was able to rescue the toxicity of Aβ1−42 in primary cortical neurons effectively.