Development, validation and in vitro applications of novel 3D models to study gamete interaction in mammals

Abstract

No todos los mecanismos moleculares implicados en la interacción entre gametos son conocidos en detalle a pesar de que este proceso ha sido ampliamente estudiado. El entendimiento en profundidad de este proceso en especies como bovino o porcino es escaso. Es por ello que es necesario desarrollar nuevas estrategias reproducibles y escalables para elucidar los mecanismos moleculares del reconocimiento entre gametos para poder mejorar las técnicas de reproducción asistida y desarrollar contraceptivos no hormonales. El objetivo principal de esta Tesis Doctoral fue desarrollar y validar una nueva herramienta in vitro para estudiar la interacción entre gametos y predecir la capacidad fecundante de una muestra seminal. El modelo tridimensional desarrollado y extensamente estudiado durante esta Tesis se basa en la conjugación de proteínas recombinantes potencialmente implicadas en la fecundación a microesferas magnéticas de sefarosa. En el capítulo 1, el modelo basado en microesferas (B) recubiertas con proteínas individuales recombinantes de la zona pelúcida (ZP) porcina (BZP) que imita la forma del ovocito fue generado, validado y caracterizado mediante SDS-PAGE, inmunotransferencia y microscopía electrónica y confocal. Las BZP imitan los complejos cúmulo-ovocito manteniendo una forma esférica además de permitir la unión de células del cumulus oophorus y presentando una superficie proteica. La conclusión del primer capítulo es que el modelo (BZP) es estable en el tiempo, permite la unión tanto de células del cumulus oophorus como de espermatozoides y proporciona una herramienta valiosa para explorar las bases moleculares del reconocimiento entre gametos en la especie porcina. En el capítulo 2, se profundiza en la aplicación del modelo como herramienta para el estudio del rol de proteínas individuales en la interacción entre gametos. Los resultados tras las distintas incubaciones del modelo con espermatozoides muestran que el 60 % de las microesferas presentan al menos un espermatozoide unido, siendo el modelo BZP2 el que presenta un mayor número de espermatozoides por microesfera y un mayor porcentaje de espermatozoides unidos que han sufrido la reacción acrosómica. Además, los modelos BZP3 y BZP4 presentan un mayor número de restos acrosomales en su superficie y un mayor porcentaje de espermatozoides no unidos a las microesferas reaccionados. El rendimiento de la fecundación in vitro (FIV) aumentó al inseminar ovocitos porcinos en presencia de BZP2. La conclusión de este segundo capítulo es que las glicoproteínas ZP3 y ZP4 están implicadas en la inducción de la reacción acrosómica mientras que ZP2 está involucrada en la unión de los espermatozoides a la ZP en la especie porcina. Por otra parte, el modelo BZP2 puede ser una herramienta útil para mejorar la eficiencia de la FIV en cerdo. Tras estudiar el rol de las glicoproteínas de la ZP de manera individual en el capítulo 2 con el modelo desarrollado en el capítulo 1, en el capítulo 3, el modelo es testeado en la especie bovina. Éste se basa en microesferas recubiertas por la proteína recombinante bovina JUNO (BJUNO) fue desarrollado y validado. Los resultados muestran que BJUNO es estable en el tiempo y los espermatozoides de toro se unen de manera específica al mismo. Además, el modelo responde de diferente manera según sea incubado con espermatozoides de distinta fuente (eyaculado vs epididimario) o con distinta capacidad fecundante (toros de alta o baja capacidad fecundante). El número de espermatozoides unidos fue mayor en aquellas microesferas incubadas con espermatozoides eyaculados y de alta capacidad fecundante respectivamente. En conclusión, se documenta un ensayo de unión de espermatozoides innovador y válido para predecir la fertilidad en mamíferos. Finalmente, estos modelos pueden ser herramientas valiosas, fácilmente desarrollables en diferentes especies, escalables y reproducibles, siendo potencialmente transferibles a la industria.

Despite gamete recognition being a widely studied process, not all the molecular mechanisms are known in detail and especially in livestock species such as porcine and bovine, the knowledge is scarce. New reproducible and scalable strategies to carry on studies in the reproductive biology field should be developed to elucidate the molecular mechanisms of gamete recognition, to improve the assisted reproductive technologies and to design new non-hormonal contraceptives. Ideally, these strategies should be easily transferable between species. The main objective of this Doctoral Thesis was to develop and validate a new in vitro tool to study gamete interaction and to predict the fertility in seminal samples. The three-dimensional (3D) model extensively studied during this thesis is based in the use of magnetic sepharose beads coated with recombinant proteins that are known to be involved in gamete interaction. In Chapter 1, the model based on magnetic sepharose beads (B) coated with single recombinant porcine zona pellucida (ZP) glycoproteins (BZP) that mimic the 3D oocyte’s shape was generated, validated and characterized by protein SDS-PAGE, immunoblot and imaging with confocal and electron microscopy. BZP closely mimic native cumulus-oocyte complexes by maintaining a spherical shape, supporting cumulus cell adhesion and providing a glycoprotein-specific surface. From these observations, the conclusions of the first chapter are that the BZP are stable through the time, support cumulus cells adhesion, sperm binding and provide a valuable tool to explore the molecular basis of gamete recognition in pigs. In Chapter 2, the application of the model to study the role of single porcine ZP glycoproteins in gamete interaction was explored. Results after sperm-BZP incubation showed that over 60 % of beads had at least one sperm bound, being BZP2 model the one with the highest number of sperm bound per bead (8.82 ± 0.63, N=289) and higher percentage of acrosome reacted sperm bound to the beads. Meanwhile, BZP3 and BZP4 models presented a higher number of acrosomal shrouds (3.77 ± 0.17 N=156; and 3.48 ± 0.15 N=153 respectively) and a higher percentage of unbound acrosome reacted sperm. IVF output increased when porcine COCs were inseminated in presence of BZP2. The conclusion of this second chapter is that ZP3 and ZP4 glycoproteins mainly induce acrosome reaction whereas ZP2 is involved in sperm-ZP binding in porcine species. Besides, BZP2 model might be a useful tool to improve the final IVF efficiency in pigs. After studying the role of the single porcine ZP glycoproteins successfully in Chapter 2, using the 3D model developed and validated in Chapter 1, in Chapter 3, the 3D model was tested in the bovine species. A new model based on beads coated with recombinant bovine JUNO protein (BJUNO) was developed and validated. Results showed that BJUNO is stable through time and bull sperm bound specifically to BJUNO. Moreover, BJUNO model responded differently when incubated with sperm from different sources (fresh ejaculated vs epididymal) or different fertilizing capacity (high vs low fertility bulls). The number of sperm bound per bead was higher when incubated with fresh ejaculated and high fertility bull sperm respectively. These findings document an innovative and valid sperm-binding assay to predict mammalian fertility by responding in a different manner between ejaculates from different fertilizing capacity. In summary, the models can be a useful tool to study the gamete interaction in depth, sperm binding, the acrosome reaction induction, the improvement of IVF protocols and they might be implemented as a semen fertility predictor in the future. These models are easily translated between species, scalable and reproducible, being a potential tool to be transferred to the industry.