Identificación de posibles factores de Myzus persicae implicados en la transmisión del virus del grabado del tabaco (TEV) y estrategias para interferir su expresión

Abstract

[ES] En esta tesis se aborda la identificación de factores del pulgón Myzus persicae que podrían participar en el proceso de transmisión del potyvirus del grabado del tabaco, Tobacco etch virus (TEV), y se explora la posibilidad de alterar la expresión de genes particulares en el insecto vector como una manera de dificultar o impedir la diseminación de este virus. Se conoce la intervención de un factor auxiliar de origen viral, la proteína HCPro, en la transmisión de potyvirus, actuando como un puente molecular reversible para retener las partículas de virus en el aparato bucal del pulgón. La proteína HCPro interacciona con la proteína de la cápside viral, CP, y previsiblemente con receptores específicos en el pulgón. Después de analizar un conjunto de productos capaces de interaccionar con la proteína HCPro de TEV (interactoma), se han considerado dos proteínas candidatas. La primera, MpRPS2, presenta homología con proteínas ribosomales, y la segunda MpRR1Cp2 es una proteína cuticular. La interacción entre HCPro y MpRPS2 se ha verificado en ensayos Far Western Blot y en el sistema de doble híbrido de levaduras. Los intentos para confirmar la localización de esta proteína en estiletes diseccionados de pulgón no fueron concluyentes, aunque con un antisuero específico sí se ha podido detectar la presencia de MpRPS2 en la cutícula de mudas de pulgón aisladas. Para validar la participación de estos hipotéticos receptores en el proceso de transmisión viral, se han explorado estrategias de interferencia con la expresión génica de MpRPS2 y MpRR1Cp2 en pulgones. Tras analizar sus niveles de expresión durante a lo largo del desarrollo, se consideraron dos sistemas para inducir respuestas de silenciamiento (RNAi) basados en la alimentación. El uso de dietas artificiales suplementadas con dobles cadenas de RNA específicas sintetizadas in vitro no produjo en general reducciones de la acumulación de RNA mensajeros, mientras que la alimentación de pulgones sobre plantas infectadas con un vector viral basado en el virus del cascabeleo del tabaco, Tobacco rattle virus (TRV), que contiene un fragmento de la secuencia del gen, tuvo un efecto más pronunciado. Las reducciones de expresión observadas fueron variables entre los dos genes, con el efecto más fuerte en el caso del gen MpRR1Cp2, en pulgones alimentados en plantas de tabaco infectadas con una variante de TRV que incorporaba un fragmento de este gen. Este sistema de RNAi nos ha permitido ensayar el efecto de la reducción de la expresión de los dos candidatos seleccionados en experimentos de transmisión de TEV. Estos resultados podrían ayudar a mejorar la comprensión de las interacciones moleculares necesarias durante la transmisión, a identificar factores en el vector que participan en el proceso, y eventualmente podrían usarse para el diseño de estrategias innovadoras de bloqueo de la diseminación viral basadas en la interferencia de la expresión de dichos factores.

[EN] This thesis addresses the identification of Myzus persicae aphid factors that could be involved in the transmission process of Tobacco etch virus (TEV), a potyvirus, and explores the possibility of altering the expression of specific genes in the insect vector as a way to prevent virus spread. An auxiliary factor of viral origin, the HCPro protein is known to participate in potyvirus transmission. HCPro acts as a reversible molecular bridge retaining virus particles in aphid mouthparts. HCPro interacts with the viral coat protein, CP, and predictably with specific receptors in aphid mouthparts. After analyzing a set of products able to interact with the TEV HCPro (interactome), we have considered two candidate proteins. The first one MpRPS2, shows homology with ribosomal proteins, and the second one, MpRR1Cp2 is a cuticular protein. The interaction between HCPro and MpRPS2 has been verified in Far Western Blot assays and in yeast two-hybrids. Attempts to confirm the localization of this protein in dissected aphid stylets were not conclusive, although using an specific antiserum it has been possible to detect the presence of the MpRPS2 in the cuticle of isolated aphid moults. To confirm the involvement of these hypothetical receptors in the viral transmission process, strategies of interference with expression of MpRR1Cp2 and MpRPS2 have been explored in aphids. After analyzing their expression levels along development, two systems based on feeding were considered to induce silencing responses (RNAi). The use of artificial diets supplemented with specific in vitro synthesized dsRNA did not produced reductions in mRNA accumulation, while aphids fed on plants infected with a viral vector based on Tobacco rattle virus (TRV), which contains a fragment of the targeted genes, showed more clear effects. The observed reductions in expression were rather variable between the two genes considered, with a stronger effect in the case of MpRR1Cp2 in aphids fed on tobacco plants infected with a TRV variant that incorporates a fragment of this gene. This RNAi system allowed us to test the effect of knocking down the expression of the two selected candidates in TEV transmission experiments. Our results might help to improve our understanding of the molecular interactions during transmission, to identify factors in the vector that participate in the process, and eventually could serve to design new strategies to interfere with viral dissemination based on specifically interfering with their expression.