Explorando el plegamiento metallo-beta-lactamasa en el genoma de Acinetobacter baumanni

Abstract

Acinetobacter baumannii fue considerado siempre como un patógeno de relativa baja virulencia, pero durante las dos últimas décadas, este microorganismo oportunista ha emergido como uno de losmayores problemas encarados por el sistema clínico en hospitales de todo el mundo. Como consecuencia inevitable de la presión selectiva impuesta por el uso abusivo de antibióticos en el tratamiento de infecciones, se han descrito cepas clínicas multirresistentes de A. baumannii, con una alta capacidad para desarrollar diferentes mecanismos de resistencia. Atendiendo a los antibióticos β-lactámicos, el principal mecanismo de resistencia es la producción de β-lactamasas, que son enzimas bacterianas capaces de degradar el antibiótico antes de que alcance su diana en la bacteria, permitiéndole a ésta una gran facilidad de adaptación al medio hospitalario y de crecimiento en asociación con su hospedador humano. Estas enzimas pueden ser clasificadas en diferentes grupos en base a su secuencia de amino ácidos o acorde a su perfil hidrolítico de sustratos e inhibidores. Dentro de esa clasificación, en este trabajo nos hemos centrado en la clase B de las β-lactamasas, que son un grupo de proteínas con una conservada estructura tridimensional, pertenecientes a una conocida superfamilia de proteínas, las metallo-β-lactamasas.

Esta superfamilia de las metallo-β-lactamasas fue por primera vez descrita por Neuwald en 1997. Sus miembros presentan una ubicua distribución a través de los tres dominios biológicos, lo cual sugiere una gran importancia funcional así como un origen ancestral. Son proteínas que se caracterizan por compartir un estable plegamiento tridimensional compuesto por cuatro regiones bien definidas, que son dos grupos centrales de láminas-beta rodeados a ambos lados por αlfa-hélices que quedan expuestas al solvente. En todas las estructuras conocidas hasta el momento, el sitio activo se sitúa entre los dos grupos de láminas beta enfrentadas, dónde uno o dos átomos metálicos, preferencialmente zinc, queda unido por una fuerte interacción con los residuos altamente conservados que confeccionan el motivo característico de esta superfamilia en su sitio activo. Este canónico plegamiento representa el mínimo dominio necesario para definir a una proteína funcional dentro de esta superfamilia, aunque gracias a diversos dominios adicionales el rango de reacciones químicas que estas proteínas pueden catalizar ha sido ampliamente extendido. Los diversos miembros fueron clasificados en 16 grupos, describiendo su variedad estructural adicional al plegamiento canónico y sus distintas funciones biológicas. Recientemente dentro de esta clasificación, un nuevo grupo 0 fue definido, el cual incluye dos enzimas sin actividad conocida por el momento, pero con un característico dominio adicional al canónico de metalo-β-lactamasa. Con el presente estudio, quisimos identificar nuevos posibles miembros de esta superfamilia dentro del genoma de A. baumannii, que a su vez pudieran intervenir de algún modo en el mecanismo general de resistencia de este conocido patógeno. A través de un meticuloso análisis de su genoma, dos genes fueron identificados, ABAYE3862 y ABAYE0164, codificando para dos proteínas putativas pertenecientes a la superfamilia de las metalo-β-lactamasas. La predicción de su estructura secundaria sugirió el canónico plegamiento en αββα de esta superfamilia, llamando nuestra atención el que ninguna de ellas presentase el conservado motivo (HXHXD/H) de unión a zinc en el sitio activo. Estas dos proteínas fueron bautizadas como aMBL-1 y aMBL-2, respectivamente, de acinetobacter Metallo-Beta-Lactamase.

Esos dos genes, ABAYE3862 y ABAYE0164, fueron clonados a partir del ADN genómico de A.baumannii y las respectivas proteínas a las que codifican, aMBL-1 y aMBL-2, fueron caracterizadas mediante las correspondientes técnicas biofísicas y bioquímicas. Además, su estructura tridimensional fue resuelta mediante cristalografía de rayos X, haciendo uso para ello de técnicas de faseo experimental, habiendo marcado previamente ambas proteínas con átomos pesados. Estas estructuras representan los primeros datos estructurales de dos nuevos miembros de esta superfamilia ya que ambas proteínas muestran el típico plegamiento metalo-beta-lactamasa aunque con ciertas particularidades. Ambas exhiben un estado de oligomerización mayoritariamente dimérico en solución, con un alongado C-terminal. En el caso de aMBL-1 representa un dominio adicional que por su similitud con los restantes miembros del grupo 0 de la MBL superfamilia podría darnos algún indicio del posible papel de aMBL-1 como transportador de señales extracelulares dentro de la bacteria. En cambio para aMBL-2, esa extensión del C-terminal es la que facilita la formación del dímero dejando los dos sitios activos de cada monómero enfrentados dentro de la U que forman ambas cadenas.

Además, los residuos del presunto sitio activo de aMBL-1 difieren ampliamente del canónico, mientras que los de aMBL-2 se asemejan bastante al motivo (HXHXD/H) de unión a zinc e incluso un átomo del metal pudo ser definido (aunque con baja ocupación) en su estructura. Con aMBL-2 creemos haber contribuido en la comprensión de la evolución de la diversidad molecular que caracteriza a esta superfamilia. La proteína aMBL-2 podría definirse como una beta-lactamasa de clase B ancestral que Acinetobacter aún conservar en su genoma, con un sitio activo inmaduro y una modesta actividad hidrolítica frente a los antibióticos beta-lactámicos.