El receptor de quimioquinas CCR7 induce ubiquitinación de proteínas en el núcleo de las células dendríticas

Abstract

[EN] Dendritic cells (DCs) are potent antigen presenting cells, key for the development of an adaptive immune response. DCs are found in peripheral tissues in an immature state, but when these cells encounter a pathogen or a “danger signal”, they undergo a process called maturation, in which, they upregulate the expression of chemokine receptor CCR7. This receptor controls the migration of DCs from the inflammation site to the lymph nodes, following the concentration gradient of its ligands, chemokines CCL19 and CCL21. In the lymph nodes, DCs will present the antigens endocyted to specific T cells to activate an adaptive response. In addition to chemotaxis, CCR7 controls other functions in DCs, such as maturation, survival, endocytosis, cytoarchitecture and migratory speed. The SCF complex (Skp1-Cul-1-Fbox containing complex) is an E3 ubiquitin ligase enzyme that mediates the ubiquitination of a large number of proteins in the cell to induce their degradation by the ubiquitin proteasome system. This complex contains the proteins Skp1, Rbx1 and Cul-1. For SCF to be activated, Cul-1 has to be modified covalently by Nedd8, an ubiquitin-like protein. This process is called neddylation.

In this study we wanted to find out if CCR7 could induce neddylation of the SCF and the functional significance of this process in DCs. First, we observed that stimulation of CCR7 with CCL21 induces neddylation of Cul-1 through Gαi protein signaling. Next, we analyzed if this neddylation could be controlling CCR7-regulated functions in DCs. In this regard, we inhibited neddylation with a drug called MLN4924 (MLN), but we observed no effect of this inhibition in CCR7 induced survival, chemotaxis, migratory speed, endocytosis or cytoarchitecture changes in DCs. We later found that neddylation of Cul-1 was occurring in the nucleus of DCs and we confirmed that Cul-1 was part of the SCF complex, along with Skp1 and Rbx1 in the nucleus. Upon CCR7 stimulation, we observed an increase in K48 polyubiquitination (K48-Poly-Ub), known to direct proteins for their degradation by the proteasome, in the nucleus of DCs. This increase was prevented by MLN treatment. A similar result was observed when Cul-1 levels were reduced with a siRNA. These results indicate that CCR7 is inducing K48-Poly-Ub of proteins in the nucleus of DCs through SCF Neddylation/activation. Consistent with these results, fluorescence microscopy analysis showed Ub was found concentrated in the nucleus of DCs co-localizing with Nedd8. Upon MLN treatment or Cul-1 reduction by a siRNA, Ub levels decreased in the nucleus of DCs. We could also detect proximity between Nedd8 and Ub, abolished when DCs were treated with MLN. Likewise, we wondered whether degradation also could be taking place in the nucleus of DCs. Our studies show there are proteasomes in the nucleus of DCs and these superstructures seem to be close to the SCF complex, suggesting degradation of ubiquitinated proteins in response to SCF could also take place in the nucleus of DCs. To find out which proteins are being ubiquitinated in response to CCR7, we carried out proteomic studies of the nuclear interactome of Cul-1. Our results indicate Cul-1 could participate in proteins metabolism, and, possibly, in the maintenance of nuclear proteostasis. In conclusion, we have observed that CCR7 can induce other types of posttranslational modifications, different from phosphorylation, such as neddylation and ubiquitination. We describe a new signaling pathway in which CCR7 induces neddylation of Cul-1 and the activation of the SCF complex. This takes place largely in the nucleus of DCs and it is responsible for the K48-Poly-Ub of proteins in this compartment. Degradation also could be taking place in the nucleus of DCs, as the presence of proteasomes seems to indicate. In this regard, we speculate CCR7 could be participating in the maintenance of nuclear proteostasis.

[ES] Las células dendríticas (CDs) son células presentadoras de antígenos que desempeñan un papel crucial en el comienzo de la respuesta inmunológica adaptativa. En los tejidos y antes de su encuentro con el antígeno, las CDs se encuentran en un estado inmaduro, sin embargo, cuando las CDs inmaduras se exponen a patógenos u otras “señales de peligro”, sufren un proceso denominado maduración o activación durante el cual, entre otros cambios, se produce el incremento en la expresión del receptor de quimioquinas CCR7. Este receptor controla la migración de las CDs maduras desde el foco de inflamación hacia los ganglios linfáticos, siguiendo un gradiente de concentración de los ligandos de CCR7, CCL19 y CCL21. En los ganglios, las CDs presentarán los antígenos endocitados a los linfocitos T específicos para generar una respuesta adaptativa. Además de la quimiotaxis, CCR7 regula otras funciones en las CDs, como la maduración, la supervivencia, la endocitosis, la citoarquitectura y la velocidad migratoria. El complejo SCF es un complejo enzimático con actividad E3 ubiquitin ligasa encargado de la ubiquitinación de numerosas proteínas en la célula para posteriormente ser degradadas por el proteasoma. Este complejo está compuesto por Skp1, Rbx1 y Cul-1. Para que el complejo se active, es necesario que la proteína de ensamblaje Cul-1 sea modificada covalentemente por Nedd8, una molécula homóloga a la ubiquitina, mediante un proceso denominado nedilación. En este trabajo estudiamos si CCR7 podía estar induciendo nedilación, y consecuente activación, de la ubiquitin ligasa SCF en las CDs y también investigamos las consecuencias funcionales de dicha activación. En primer lugar, observamos que la estimulación de CCR7 con CCL21 inducía nedilación de Cul-1 a través de la señalización mediada por la familia de proteínas de Gαi. Posteriormente analizamos si dicha nedilación podía estar mediando alguna de las funciones reguladas por CCR7 en las células dendríticas. Sin embargo, observamos que la inhibición farmacológica de la nedilación con MLN4924 (MLN) no afectaba a las funciones reguladas por CCR7, incluyendo, la supervivencia, quimiotaxis, velocidad migratoria, endocitosis o la citoarquitectura de estas células.

Sorprendentemente, observamos que la nedilación de Cul-1 ocurría en el núcleo de las CDs. En este sentido, se comprobó que Cul-1 se encontraba en el núcleo formando parte del complejo SCF con Skp1 y Rbx1. En este trabajo también observamos que la estimulación de CCR7 indujo poliubiquitinación tipo K48 (Poli-Ub-K48), relacionada con la degradación proteasomal, en el núcleo de las CDs. Dicho incremento en Poli-Ub-K48 se inhibió cuando las células fueron pretratadas con MLN. La reducción en los niveles de Cul-1 mediante un siRNA tuvo un efecto similar sobre la Poli-Ub-K48 inducida por CCR7. Estos resultados sugieren que CCR7 induce la Poli-Ub-K48 de proteínas a través de la nedilación de Cul-1, lo cual induce activación de la E3 ligasa SCF en el núcleo de las CDs. Apoyando este concepto, nuestros estudios indican que la ubiquitina (Ub) colocaliza con Nedd8 en el núcleo de las CDs y además la Ub nuclear desaparece cuando se inhibe la nedilación con MLN o cuando se silencia Cul-1 mediante un siRNA. Finalmente, analizamos si la degradación de las proteínas ubiquitinadas podía estar ocurriendo en el mismo núcleo de las CDs. Nuestros estudios mostraron la presencia de un componente del proteasoma 26S en el núcleo de las CDs y su posible cercanía con el complejo SCF, sugiriendo que la degradación de las proteínas ubiquitinadas en respuesta a CCR7 podría darse en el núcleo de las CDs. Con el fin de averiguar qué proteínas se ubiquitinan en respuesta a la estimulación de CCR7, se realizaron estudios de proteómica precipitando Cul-1 de extractos de proteínas nucleares. El análisis del interactoma de Cul-1 sugiere que esta proteína puede estar participando en el metabolismo de proteínas, y, posiblemente, en el mantenimiento de la proteostasis nuclear. En conclusión, nuestros resultados indican que CCR7 puede inducir otros tipos de modificaciones post-traduccionales diferentes a la fosforilación, como es la nedilación y la ubiquitinación. Este trabajo describe una nueva vía de señalización regulada por CCR7 que induce la nedilación de Cul-1 y la activación de SCF en el núcleo de las CDs. Este complejo es responsable de la Poli-Ub-K48 de proteínas nucleares. La presencia de proteasomas y su cercanía a SCF sugieren que la degradación de proteínas puede darse en el núcleo de las CDs. En este sentido, los datos obtenidos permiten especular que CCR7 podría estar participando en el mantenimiento de la proteostasis nuclear