Impact of diabetes on exocytosis/neurotransmitter release in the retin

Abstract

A retinopatia diabética é uma das principais causas de perda de visão e cegueira no mundo. Esta patologia é considerada uma doença vascular. No entanto, tem sido demonstrado que a parte neural da retina também é afetada, mesmo antes de serem detetadas lesões microvasculares. As alterações registadas em eletroretinogramas de pacientes e animais diabéticos, e a perda de sensibilidade à cor e ao contraste são sinais precoces de disfunção neuronal na retina. Contudo, as alterações moleculares e celulares causadas pela diabetes na retina não estão completamente esclarecidas. Assim, o objetivo principal deste trabalho consistiu em clarificar o impacto da diabetes, e de condições que mimetizam hiperglicemia e processos inflamatórios, na retina neural, a nível molecular, tendo-se dado uma atenção particular a alterações a nível pré-sináptico, e a nível celular, nomeadamente ao impacto nos diferentes tipos de células, neurónios, células da glia e microglia. Inicialmente, avaliou-se o efeito da diabetes no conteúdo de proteínas sinápticas envolvidas em processos de exocitose e libertação de neurotransmissores. A diabetes foi induzida com uma única injeção de estreptozotocina, em ratos Wistar. Os níveis proteicos das SNAREs (sintaxina-1, VAMP-2 e SNAP-25), sinapsina-1, sinaptotagmina-1, sinaptofisina e rabfilina 3a, foram analisados em terminais nervosos purificados e em extratos totais de retina, durante fases iniciais da diabetes (duas, quatro e oito semanas). Nos terminais nervosos, os níveis de VAMP-2 diminuíram às duas semanas, aumentaram às quatro semanas e foram semelhantes ao controlo às oito semanas. Os níveis de sintaxina-1 e sinaptofisina diminuíram nos terminais nervosos após duas semanas, mas às quatro e oito semanas de diabetes recuperaram, sugerindo que a retina é capaz de reagir/recuperar do insulto inicial causado pela diabetes. O conteúdo da sinapsina-1 diminuiu significativamente em terminais nervosos de retina em todos os tempos de estudo. Por sua vez, os níveis de SNAP-25, sinaptotagmina-1e rabfilina 3a não foram alterados pela diabetes. Em extratos totais de retina, não se detetaram alterações nos níveis das proteínas sinápticas, demonstrando que as alterações estavam a ocorrer especificamente a nível pré-sináptico. Estes resultados indicam que a diabetes afeta diferencialmente o conteúdo de proteínas exocitóticas em terminais nervosos de neurónios da retina. Tendo em conta que alterações na exocitose podem contribuir para alterações na libertação de neurotransmissores, avaliou-se também o impacto da diabetes (duas e oito semanas) na libertação basal e evocada de [14C]glutamato e [3H]GABA, em terminais nervosos de retina. Os níveis proteicos de VGluT-1, VGluT-2, VGAT e da subunidade α1A dos canais de cálcio P/Q também foram analisados. Após duas semanas de diabetes, o conteúdo proteico de VGluT-1, VGluT-2, VGAT e da subunidade α1A dos canais de cálcio P/Q diminuiu nos terminais nervosos de retina, enquanto que às oito semanas de diabetes não foram detetadas alterações, com a exceção do VGAT, cujos níveis de encontravam aumentados. Uma vez mais, não foram detetadas alterações nos níveis das proteínas sinápticas em extratos totais de retina. Relativamente à libertação de neurotransmissores, os níveis de libertação do glutamato foram demasiado baixos para se poder inferir alguma conclusão. A libertação evocada de GABA diminuiu após 8 semanas de diabetes. Estes resultados indicam que a diabetes pode afetar o terminal pré-sináptico, o que poderá levar a alterações na transmissão sináptica. Dado que a hiperglicemia é considerada o principal fator causador das complicações associadas à diabetes, investigou-se se a exposição prolongada a glucose elevada por si só, procurando mimetizar uma situação de hiperglicemia, alteraria o conteúdo proteico e a localização de proteínas sinápticas envolvidas no processo de exocitose (sintaxina-1, VAMP-2, SNAP-25, synapsina-1, sinaptotagmina-1, sinaptofisina, rabfilina, VGLUT e VGAT), em culturas primárias de células de retina. As células foram expostas durante quatro ou sete dias, a glucose elevada (30 mM) ou manitol (25 mM; + 5 mM de D-glucose), que foi usado como controlo osmótico. A exposição a glucose elevada não alterou a morfologia neuronal. Adicionalmente, o conteúdo proteico total e distribuição celular das proteínas estudadas envolvidas na exocitose mantiveram-se inalterados, sugerindo que a hiperglicemia poderá não ser o fator principal que contribui para as alterações neuronais causadas pela diabetes, ocorrendo possivelmente uma combinação da hiperglicemia com outros fatores, nomeadamente a falta de insulina e a inflamação. Existem cada vez mais evidências que sugerem que a inflamação será um importante fator que contribui para o desenvolvimento de retinopatia diabética. No entanto, tem sido dada pouca atenção aos efeitos de mediadores pró-inflamatórios, e em particular da IL-1β, nos diferentes tipos celulares da retina, e à forma como os diferentes tipos de células interagem numa situação de inflamação. Neste trabalho, avaliou-se se a glucose elevada per se seria capaz de alterar a expressão de IL-1β em culturais de células de retina. Adicionalmente, procurou-se identificar o tipo de células que expressam IL-1β e IL-1R1, e investigou-se o efeito da exposição a glucose elevada e IL-1β em cada tipo celular, de modo a elucidar qual o tipo celular mais afetado nas culturas primárias de retina. A exposição das culturas a glucose elevada causou um aumento da expressão de IL-1β. A glucose elevada e a IL-1β também afetaram diferencialmente a proliferação das células da microglia e da macroglia. Enquanto a exposição a elevada glucose diminui a proliferação das células da macroglia e microglia, a IL-1β aumentou a proliferação destes dois tipos de células. A exposição a IL-1β, durante 24 horas, não causou morte celular, nem induziu alterações nos níveis de proteínas sinápticas e marcadores neuronais. As alterações detetadas, em sinaptossomas de retina, nos níveis de proteínas sinápticas envolvidas na exocitose, sem se terem registado alterações nos extratos totais de retina, juntamente com evidências de estudos anteriores, sugerem que o transporte axonal na retina pode estar a ser afetado pela diabetes. Desta forma, analisou-se o efeito da diabetes e da exposição a glucose elevada no conteúdo proteico e distribuição das proteínas motoras KIF1A, KIF1B e dineína, que são responsáveis pelo transporte axonal nos neurónios. As proteínas motoras KIF1A e KIF5B foram particularmente afetadas pela diabetes na retina, tendo-se detetado uma diminuição dos níveis proteicos de KIF1A e da imunoreatividade da KIF1A e KIF5B nas várias camadas da retina, o que pode contribuir para alterações no transporte anterógrado, e consequentemente para a disfunção neuronal na retina. Contudo, não foram detetadas alterações no conteúdo proteico e distribuição celular das proteínas motoras após exposição a glucose elevada durante 7 dias, sugerindo que as alterações observadas numa condição de diabetes, poderão resultar de outros fatores, como por exemplo a falta de insulina ou processos inflamatórios, e não propriamente devido à hiperglicemia per se . Por outro lado, efeitos sinérgicos destes fatores poderão ser mais relevantes do que os potenciais efeitos de cada um dos fatores por si só. A diabetes também tem sido associada a alterações cognitivas e de memória, sugerindo que o hipocampo é afetado por esta patologia. As alterações induzidas pela diabetes, detetadas ao nível de proteínas exocitóticas, em sinaptossomas de hipocampo, assim como as alterações detetadas em culturas primárias de hipocampo expostas a glucose elevada, nas quais se registou uma acumulação de algumas proteínas sinápticas no corpo celular, sugerem que o transporte destas proteínas para a sinapse pode estar afetado. Assim, investigou-se se a diabetes poderia afetar os níveis proteicos e a distribuição de algumas proteínas motoras no hipocampo. Em culturas primárias de hipocampo, também se avaliou se a glucose elevada poderia afetar os níveis e distribuição de proteínas motoras e sinápticas, e de mitocôndrias, dando particular atenção a eventuais alterações nos axónios. Detetaram-se alterações nas proteínas motoras KIF1A e KIF5B no hipocampo de rato, 8 semanas após indução da diabetes. Adicionalmente, em axónios de neurónios de hipocampo em cultura, a exposição a glucose elevada causou alterações em proteínas motoras responsáveis pelo transporte anterógrado de proteínas sinápticas importantes para a exocitose, nomeadamente KIF1A e KIF5B. A exposição a glucose elevada também aumentou o número de acumulações de KIF-1A e sinaptotagmina-1, e causou uma diminuição da imunoreactividade de KIF5B, SNAP-25 e sinaptofisina, especificamente nos axónios de neurónios de hipocampo. Estas alterações sugerem que o transporte anterógrado mediado por estas cinesinas pode estar alterado em neurónios de hipocampo, o que poderá contribuir para as alterações já detetadas na neurotransmissão no hipocampo de pacientes e animais diabéticos. Como conclusão, este estudo sugere que a diabetes induz alterações nos terminais présinápticos na retina, nomeadamente ao nível do conteúdo proteico de várias proteínas sinápticas envolvidas na exocitose. A libertação de neurotransmissores na retina também poderá ser afetada pela diabetes. As proteínas motoras responsáveis pelo transporte axonal anterógrado também são afetadas pela diabetes quer na retina quer no hipocampo. No entanto, a exposição prolongada a glucose elevada não induziu alterações significativas tanto ao nível das proteínas sinápticas como das proteínas motoras em culturais de células de retina, sugerindo que outros fatores, tais como a falta de insulina e inflamação, provavelmente atuando sinergicamente com a hiperglicemia, poderão contribuir para alterações neurais na retina e hipocampo. Embora cada fator isolado possa ter alguns efeitos, os resultados apresentados neste trabalho sugerem que é a combinação de fatores, que agindo simultaneamente, leva à disfunção neuronal. No seu conjunto, os efeitos da diabetes na retina e hipocampo poderão contribuir para as alterações visuais e cognitivas detetadas em animais e pacientes com diabetes.

Diabetic retinopathy is a leading cause of vision loss and blindness worldwide. Although it is considered a microvascular disease, increasing evidence has shown that the neural components of the retina are also affected, even before the detection of microvascular dysfunction. Alterations in electroretinograms in diabetic patients and animals, and loss of colour and contrast sensitivity are early signs of neural dysfunction in the retina. Nevertheless, the molecular and cellular alterations caused by diabetes in the retina are not fully understood. Thus, our main goal was to further clarify the effects of diabetes, hyperglycemic like and inflammatory like conditions, in the neural retina, at molecular and cellular level. We gave a particular attention to changes occurring at the presynaptic level, as well as the impact on different cell types, namely neurons, glial and microglial cells. Firstly, we evaluated the effect of diabetes, on the content of synaptic proteins involved in exocytosis and on neurotransmitter release. Diabetes was induced in Wistar rats with a single intraperitoneal injection of streptozotocin. The protein levels of SNAREs (syntaxin-1, VAMP-2 and SNAP-25), synapsin-1, synaptotagmin-1, synaptophysin, and rabphilin 3a were evaluated in purified nerve terminals and in total extracts of retina, during the early stages of diabetes (two, four and eight weeks). In retinal nerve terminals, VAMP-2 levels decreased at two and increased at four weeks of diabetes, and were similar to those found in control animals at eight weeks of diabetes. Syntaxin-1 and synaptophysin levels decreased at two weeks of diabetes, but at four and eight weeks were similar to controls, suggesting that the retina is able to recover from, or react to, the initial insult caused by diabetes. Synapsin-1 content decreased in retinal nerve terminals at all time points studied. SNAP-25, synaptotagmin-1 and rabphilin 3a levels remained unchanged in retinal nerve terminals at all time points. No changes were observed in the levels of exocitotic proteins in total extracts, showing that the changes detected were specifically occurring at presynaptic level. These results indicate that diabetes differentially affects the content of exocytotic proteins in retinal nerve terminals. Since the impairment in exocytosis may contribute to changes in neurotransmitter release, we also evaluated the effect of diabetes (two and eight weeks) on both basal and evoked release of [14C]glutamate and [3H]GABA in retinal nerve terminals. The protein levels of VGluT-1, VGluT-2, VGAT and α1A subunit of P/Q calcium channels were also analyzed. At two weeks of diabetes, the content of VGluT-1, VGluT-2, VGAT and α1A subunit decreased in retinal nerve terminal. At eight weeks of diabetes no changes were detected, with the exception of VGAT levels, which were increased. Again, no changes were detected in the content of these proteins in retinal total extracts. Regarding neurotransmitter release, the levels of glutamate released were too low to draw ant conclusion. However, the evoked release of GABA decreased at eight weeks in retinal nerve terminals. These results further indicate that diabetes can affect the pre-synaptic terminal, which may cause impairments in synaptic transmission. Given that hyperglycemia is considered the main trigger of diabetic complications, we analyzed whether long-term high glucose, to mimic a prolonged hyperglycemic condition, could changes the content and localization of synaptic proteins involved in exocytosis (syntaxin-1, VAMP-2, SNAP-25, synapsin-1, synaptotagmin-1, synaptophysin, rabphilin 3a, VGluT-1 and VGAT) in primary retinal cultures. Neurons were exposed for four or seven days to high glucose (30 mM) or mannitol (25 mM; plus 5 mM D-glucose), which was used as osmotic control. Neuronal morphology was not significantly affected by high glucose. Moreover, prolonged elevated glucose did not alter both the total content and cellular distribution of proteins involved in exocytosis, suggesting that hyperglycemia may not be the primordial factor contributing for neuronal changes caused by diabetes, but rather a combination of hyperglycemia with other factors, such as the lack of insulin and inflammation. Increasing evidence indicates that inflammation is an important player in the pathogenesis of diabetic retinopathy. Increased levels of cytokines, as for example IL-1β, have been found in the retina of diabetic animals. Little attention has been given to the effect of high glucose and IL-1β on different retinal cell types and how these cell types interact under an inflammatory condition. We evaluated if high glucose per se was capable of changing the expression of IL-1β in retinal neural cells. Moreover, we identified which cell types produce IL-1β and express IL-1RI and studied the cell-specific effects of high glucose and IL-1β in retinal neural cultures, to elucidate which cell types are mostly affected. Cell proliferation, viability and death and expression of specific cell markers will be evaluated in primary retinal cultures. We showed that high glucose per se upregulates the levels of IL-1β in retinal neural cells. Additionally, high glucose and IL-1β differently affected microglial and glial cells, changing their proliferation in retinal neural cultures. High glucose, decreased glial and microglial cell proliferation, whereas under IL-1β their proliferation increased. Moreover, IL-1β did not induced changes in cell death and in the levels of synaptic proteins and neuronal markers, suggesting that activated microglia is not having a deleterious effect in neuronal cells, at least for 24h of exposure to IL-1β. The changes detected in the levels of exocytotic synaptic proteins in retinal synaptosomes, with no changes in total extracts, together with other evidences reported by previous studies, suggest that axonal transport in the retina may be impaired in diabetes. We analyzed the effect of diabetes and high glucose on the content and distribution of KIF1A, KIF5B and dynein motor proteins that are responsible for axonal transport in neurons. KIF1A and KIF5B motor proteins were affected by diabetes in the retina, namely in the content of KIF1A and distribution of KIF1A and KIF5B in the retinal layers decreased, which may contribute to impaired anterograde axonal transport and consequently to neuronal dysfunction in the retina. No changes were detected in the content and cellular distribution of motor proteins in primary retinal cells after exposure to high glucose for 7 days, suggesting that the changes observed in motor proteins under diabetes, may be probably due to insulin deficiency rather than hyperglycemia. Diabetes has also been associated with cognitive and memory impairments, suggesting that hippocampus is affected by this disease. Previous detected changes in the levels of exocytotic proteins in hippocampal synaptosomes induced by diabetes and in hippocampal cell cultures exposed to elevated glucose, where an accumulation of some of these proteins was found at the cell body, suggests that the axonal transport of these proteins to the synapse may be affected. We evaluated the effect of early diabetes and high glucose on the content and distribution of KIF1A, KIF5B and dynein motor proteins in the hippocampus and hippocampal neurons, respectively. We also evaluated whether high glucose per se in cultured hippocampal neurons, could affect the levels and distribution of motor proteins, synaptic proteins and mitochondria, giving particular attention to changes in axons. KIF1A and KIF5B motor proteins were altered in the hippocampus of diabetic rats at 8 weeks of diabetes. Moreover, in the axons of hippocampal neurons, high glucose leads to changes in KIF1A and KIF5B, motor proteins responsible for the anterograde axonal transport of synaptic proteins important for exocytosis. High glucose increased the number of fluorescent accumulations of KIF1A and synaptotagmin-1 and decreased KIF5B, SNAP- 25 and synaptophysin immunoreactivity specifically in axons of hippocampal neurons. These changes suggest that anterograde axonal transport mediated by these kinesins may be impaired in hippocampal neurons, which may lead to deficts in the anterograde transport of synaptic proteins, thus contributing to previously detected changes in neurotransmission in the hippocampus of diabetic humans and animal models. In conclusion, diabetes induces changes in the presynaptic compartment in the retina, namely in the content of several synaptic proteins involved in exocytosis. Neurotransmitter release can also be affected. Anterograde axonal transport motor proteins are affected by diabetes in the retina and hippocampus of diabetic animals. Nevertheless, a prolonged exposure of retinal cell cultures to elevated glucose did not induce significant changes in both synaptic and motor proteins, suggesting that other factors, such as the lack of insulin and inflammation, likely acting synergistically with hyperglycemia, might contribute to neural changes in the retina, and hippocampus. Although each factor isolated may have some effects, the results presented in this work suggest that it’s the combinatory range of factors acting simultaneously that result in neuronal dysfunction. Altogether, these alterations might contribute to visual and cognitive impairments detected in diabetic animals and humans.