Autophagy in cortical neurons : role of caloric restriction and neuropeptide Y

Abstract

O envelhecimento é um processo complexo e multifatorial, cujos mecanismos moleculares permanecem ainda desconhecidos. O cérebro é o órgão mais afetado pelo processo de envelhecimento, estando as doenças neurodegenerativas diretamente relacionadas com o aumento da idade. O aumento da esperança média de vida, e o consequente aumento da prevalência de declíneo cognitivo, impulsionou a investigação na área do envelhecimento, a fim de desenvolver estratégias que contribuam para o aumento da esperança de vida com qualidade. A restrição calórica é uma das estratégias não farmacológicas que promove o aumento da esperança de vida em diferentes organismos. A autofagia, um processo intracelular altamente regulado, envolvido na reciclagem de constituintes celulares e na manutenção da homeostase celular, está envolvida nos mecanismos anti-envelhecimento da restrição calórica. Além disso, os efeitos anti-envelhecimento induzidos pela restrição calórica foram relacionados com alterações no sistema neuroendócrino, nomeadamente o aumento do neuropeptídeo Y (NPY) no núcleo arqueado do hipotálamo. O NPY é um dos peptídeos mais abundantes no sistema nervoso central, tendo um efeito neuroprotector em diversas áreas cerebrais. Estudos sugerem que o NPY pode ser um mediador dos efeitos anti-envelhecimento promovidos pela restrição calórica; no nosso grupo demonstrámos que o NPY não só induz autofagia em neurónios hipotalâmicos, como também medeia a autofagia induzida pela privação de nutrientes, sugerindo que este neuropeptídeo possa estar envolvido nos efeitos benéficos induzidos pela restrição calórica. No entanto, o efeito do NPY na autofagia em outras regiões cerebrais, nomeadamente no córtex, bem como o seu potencial papel no aumento da esperança de vida, é desconhecido. Um outro efeito neuroendócrino promovido pela restrição calórica é o aumento dos níveis de grelina, um peptídeo orexigénico secretado pelo estômago. A grelina, de forma similar ao NPY, mimetiza muitos dos efeitos induzidos pela restrição calórica, atuando possivelmente como um importante mediador metabólico nos seus efeitos anti-envelhecimento. Contudo, o efeito da grelina na autofagia induzida pela restrição calórica ainda não foi investigado. Neste estudo avaliou-se o efeito da privação de nutrientes na autofagia em neurónios corticais de rato bem como o possível envolvimento do NPY e seus recetores neste processo. Neste trabalho também se estudou o efeito do NPY per se na regulação da autofagia e as vias de sinalização envolvidas. O potencial envolvimento da grelina e do seu recetor na autofagia induzida por restrição calórica, tal como, o efeito da grelina na modulação da autofagia em neurónios corticais também foi avaliado. 12 Este estudo mostrou que a privação de nutrientes induz autofagia em neurónios corticais, de uma forma dependente do tempo de exposição. A indução da autofagia foi mediada pelos recetores Y1, Y2 e Y5 do NPY, envolvendo diferentes vias de sinalização. Paralelamente à promoção da autofagia, a privação de nutrientes induziu um aumento dos níveis de NPY em neurónios corticais, reforçando o envolvimento do NPY na autofagia mediada por privação de nutrientes. Posteriormente, avaliou-se o efeito do NPY per se na regulação da autofagia em neurónios corticais. À semelhança da privação de nutrientes, o NPY também aumentou o fluxo autofágico, de uma forma dependente do tempo de exposição, sendo este efeito mediado pela activação dos recetores Y1, Y2 e Y5 do NPY. Para além do NPY, a restrição calórica também aumenta os níveis de grelina. Deste modo, estudou-se o envolvimento deste peptídeo na indução da autofagia mediada por privação de nutrientes. A grelina não só induziu a autofagia em neurónios corticais, como também contribuiu para o aumento do fluxo autofágico induzido pela privação de nutrientes. Este estudo mostrou, pela primeira vez, que o NPY e a grelina, considerados miméticos da restrição calórica, promovem a autofagia em neurónios corticais. Adicionalmente, em resposta a uma baixa disponibilidade de nutrientes, estes neurónios expressam NPY e grelina. Tendo em conta que os processos autofágicos estão comprometidos no envelhecimento e nas doenças neurodegenerativas associadas à idade, o efeito sinergístico do NPY e da grelina na regulação da autofagia pode ser considerado um ponto de partida para o desenvolvimento de novas estratégias para retardar o envelhecimento e aumentar a longevidade aliada a uma melhor qualidade de vida.

Aging is determined by complexes and multifactorial processes, whose molecular basis remains poorly understood. The brain is the most affected organ by the aging process, and neurodegenerative diseases are directly related with the increased age. Since average human life expectancy has increased, and consequently, the prevalence of cognitive decline and dementia, aging research is now focused in finding strategies that increase both lifespan and healthspan. Caloric restriction (CR) is one of the few non-pharmacological manipulations that has been reported to consistently extend lifespan of different organisms. Increasing evidence shows that autophagy, a highly regulated intracellular process involved in the turnover of most cellular constituents and in the maintenance of cellular homeostasis, is involved in anti-aging mechanisms of CR. Furthermore, the anti-aging effects induced by CR were related to changes in the neuroendocrine system, namely the increase of neuropeptide Y (NPY), a potent neuroprotective agent in several brain areas, in the hypothalamic arcuate nucleus (ARC). Evidence suggests that NPY might play an important role in CR anti-aging effects, and in our group was found that NPY not only induces autophagy in hypothalamic neurons, but also mediates nutrient deprivation-induced autophagy in these cells, suggesting that NPY might mediate CR’s effects on autophagy. However, the effect of NPY in autophagy in the whole brain, namely in the cortical neurons, as its potential role in lifespan extension, is currently not known. CR is also known to increase the levels of ghrelin, an orexigenic peptide secreted by the stomach. Ghrelin, similarly to NPY, shares some physiological effects induced by CR, possibly acting as an important metabolic mediator in its anti-aging effects. However, the effect of ghrelin in nutrient deprivation induced autophagy has not been studied yet. The first goal of this study was to evaluate the effect of CR on autophagy in rat cortical neurons, scrutinizing the involvement of NPY and its receptors in this process, as the signaling pathways involved. With this study it was also intended to evaluate the effect of NPY on the regulation of autophagy in cortical neurons, investigating which NPY receptors subtypes and signaling pathways are involved in NPY-induced autophagy. It was also investigated the potential involvement of ghrelin and its receptor on CR-induced autophagy, as well as ghrelin’s effect in the modulation of autophagy in cortical neurons. This study showed that nutrient deprivation induces autophagy in rat cortical neurons. Upon nutrient deprivation it was observed an autophagy induction in a time dependent manner, as proved by the enhancement of the autophagic flux, using chloroquine, a lysosomal degradation inhibitor. The autophagy induction was mediated by NPY Y1, Y2 and Y5 receptors, and involves different signaling pathways. Concomitant with autophagy activation, NPY levels 10 content increased when cortical neurons undergo nutrient deprivation, supporting the involvement of NPY in nutrient deprivation-induced autophagy. We next evaluated the effect of NPY per se on autophagy regulation in cortical neurons. NPY, similarly to nutrient deprivation, increased autophagic flux in a time dependent manner, and this effect was mediated by NPY Y1, Y2 and Y5 activation. Besides NPY, CR also increases the levels of ghrelin, an orexigenic peptide secreted by the stomach, which has been suggested to act as a metabolic regulator signal during CR. Therefore we investigated whether ghrelin, similarly to NPY, could be involved in nutrient deprivation-induced autophagy in cortical neurons. Ghrelin not only induces autophagy in cortical neurons but also contributes to the increase in the autophagic flux induced by nutrient deprivation. This study showed, for the first time, that NPY and ghrelin, both considered caloric restriction mimetics, enhance autophagy in cortical neurons. Furthermore, in response to low nutrient availability, these neurons express NPY and ghrelin. Given that autophagy impairment underlies aging and age-related neurodegenerative diseases, NPY and ghrelin synergistic effect on the regulation of autophagy can be considered a stepping stone for the development of new strategies to delay the aging process and promote healthy lifespan.