Impact of chemotherapeutics drugs in NK-mediated killing by over expression of death receptors on cancer cells

Abstract

Background: Bladder Cancer (BC) is the fifth most incident cancer worldwide. It is characterized by a high recurrence rate, probably due to the presence of a small population of cells within the tumor, named cancer stem cells (CSCs), responsible for therapeutic resistance and relapse after initial therapy. Therefore, new therapeutic approaches are needed to eliminate all tumor cells, preventing the tumor recurrence. In this context, natural killer(NK) cells-based therapy has emerged as an alternative strategy, alone or in combination with other therapeutic modalities, to treat BC. Herein, we evaluate the effect of sub-apoptotic concentrations of doxorubicin (DOX) and bortezomib (BTZ) in sensitizing tumor BC cell lines to NK-mediated killing, through death receptors (Fas and DR5) upregulation. Methods: Two BC cell lines (UM-UC3 and HT-1376) and their corresponding CSCs, isolated through the sphere-forming assay, were incubated with sub-apoptotic concentrations of DOX (0.05μM and 0.1μM) and BTZ (5nM and 10nM) for 24h or 48h to measure the gene expression of death receptors, using the qRT-PCR technique. Subsequently, a 20h 51chromium release assaywas performed to evaluate the NKmediated killing, via death receptors signaling, in pre-treated tumor cells. Additionally, qRT-PCR was performed to assess the death receptors expression pattern among different stages of BC, using clinical samples. Results:Pre-treatment with sub-apoptotic concentrations of DOX and BTZ induces a significant upregulation of both death receptors in BC parental cells. Compared to untreated cells, the pre-treatment of parental cells with 0.05μM DOX and 0.1nM BTZ promotes a significant increase in NK cells anti-tumor response, through a perforinindependent mechanism. The CSCs population was less responsive to DOX- or BTZinduced death receptors upregulation, and consequently less susceptible to NK cells mediated killing. Furthermore, death receptors gene expression increases progressively with the BC tumor stage. Conclusions:Our data demonstrates that a pre-treatment with low concentrations of DOX and BTZ sensitizes parental BC tumor cells to NK-mediated killing by inducing an XXIV upregulation of death receptors. The CSCs populations express low basal levels of death receptors and is less sensitive to NK cell-mediated killing by death-receptors. Altogether these results suggest that a combination of DOX or BTZ with NK-based immunotherapy may increase the antitumor efficacy against differentiated BC cells but are less effective against CSCs. The expression of death receptors in BC correlates with tumor stage and aggressiveness, suggesting that it might be used as a prognostic marker in BC.

Introdução:O cancro da bexiga (BC, do inglês bladder cancer)é a quinta neoplasia mais comum em todo o mundo. É caracterizado por uma alta taxa de recidiva, provavelmente devido à presença de uma pequena população de células, designada de Células Estaminais Cancerígenas (CSCs, do inglês Cancer Stem Cells), responsável pela resistência à terapêutica e a recidiva após a terapia inicial. Assim sendo, são necessárias novas abordagens terapêuticas de modo a eliminar completamente o tumor, prevenindo o seu reaparecimento. Neste contexto, a terapia com base em células natural killer (NK) tem sido estudada como uma estratégia alternativa, sozinha ou em combinação com outras terapias, para o tratamento do BC. Neste trabalho avaliamos o efeito de concentrações sub-apoptóticas de doxorubicina (DOX) e bortezomib (BTZ) na sensibilização das células tumorais do BC à morte mediada pelas células NK, através do aumento de expressão dos receptores de morte. Métodos:Duas linhas celulares de BC (UM-UC3 e HT-1376) assim como as suas respectivas CSCs, isoladas através do método de formação de esferas, foram incubadas com concentrações sub-apoptóticas de DOX (0.05μM e 0.1μM) E BTZ (5nM e 10nM) durante 24h e 48h de modo a medir a expressão génica dos receptores de morte, usando a técnica de PCR em tempo real. De seguida foi realizado um ensaio de libertação de 51crómio de forma a avaliar a morte mediada pelas células NK, através da via dos receptores de morte, em células pré-incubadas com DOX e BTZ. Adicionalmente, um ensaio de qRT-PCR, utilizando amostras clínicas, foi elaborado de modo a avaliar o padrão de expressão dos receptors de morte nos vários estadios do BC. Resultados:O pré-tratamento com concentrações sub-apoptóticas de DOX e BTZ induz um aumento significativoda expressão dos receptores de morte nas células parentais do BC. Comparando com células não tratadas, o pré-tratamento de células parentais com 0.05μM DOX e 0.1nM BTZ promove um aumento significativo da resposta anti-tumoral das células NK, através de um mecanismo independente da perforina. A população de CSCs foi menos sensível à regulação dos receptors de de morte induzida pela DOX e BTZ e, consequentemente menos sensível à morte celular mediada pelas células NK. XXVI Conclusão:O nosso estudo demonstra que o pré-tratamento com baixas concentrações de DOX e BTZ sensibiliza as células tumorais de BC para a morte mediada pelas células NK devido ao aumento da expressão dos receptores de morte. As populações de CSCs expressam baixos níveis basais de receptores de morte e são menos sensíveis à morte mediada pelas células NK, através destes receptores.No seu conjunto, estes resultados sugerem que a combinação de DOX e BTZ com a immunoterapia baseada em células NK pode aumentar a eficácia da resposta anti-tumoral contra células parentais mas é menos sensível contra CSCs. A expressão de receptores de morte no BC correlaciona-se com o estadio e agressividade tumoral, sugerindo que os receptores de morte poderão ser usados como marcadores de prognóstico