Astrocytic A2A receptors : novel targets to manage brain disorders

Abstract

Adenosine is a prototypic modulator of synaptic transmission in the CNS; it mainly controls excitatory transmission through a coordinated action of inhibitory A1 receptors and facilitatory adenosine A2A receptors (A1R, A2AR) and, albeit their physiological and pathological role have mainly been assumed to result from their direct action on neurons, they are also present in astrocytes where they control astrogliosis, proliferation, cell death, and the release of neurotrophic factors and interleukins. Astrocytes are the dominant subclass of non-neuronal glial cells of the brain; they are physically associated with synapses prompting the tripartite synapse concept to highlight their relevance in integrating neuronal networks by reciprocal chemical signaling. Astrocytes format synaptic plasticity since they are responsible for clearance of extracellular glutamate through glutamate transporters. This highlights the crucial involvement of astrocytes on the abnormal glutamate over-excitation implicated in both acute CNS injuries and diverse chronic neurodegenerative disorders. The group of Purines at CNC recently showed that astrocytic glutamate uptake is diminished upon activation of astrocytic A2AR, both under physiological and pathological conditions, which supports the ability of astrocytic A2AR to control pathophysiological processes involving the activity of glutamate transporters. Additionally, A2AR are aberrantly up-regulated upon different brain insults. Therefore, we now prompted the hypothesis of blocking astrocytic A2AR as a novel and promising strategy to prevent abnormal glutamate over-excitation, thus preventing biochemical-, functional- and behavioural-associated modifications. Hence, we sought to validate novel tools for selectively and region-specific down-regulate astrocytic A2AR to further probe their efficacy under physiological and pathological conditions. This work was organized in 2 main steps: i) we first incorporated into a lentivector coated with Mokola Lyssavirus G glycoprotein (Mok-G) an RNA interference strategy to down-regulate A2AR also carrying a reporter gene, enhanced green fluorescent protein (EGFP) to allow cells to be identifiable,; ii) we then tested whether Mok-G coated lentivirus were able to selectively and efficiently transduce astrocytes in vitro (primary astrocyte cell cultures) and in vivo (into selected brain regions such as prefrontal cortex, striatum and hippocampus) for delivering shA2AR constructs to downregulate A2AR expression and density. We evaluated viral spreading and cell-type transduction through immunofluorescent co-localization of the reporter gene EGFP with glial (GFAP and vimentin) and neuronal (NeuN) markers. The present study showed that Mokola-G-coated lentivirus encoding shA2AR successfully infects astrocytes and down-regulate astrocytic A2A receptors expression and density, at least in vitro. Major concerns should be considered when it comes to their in vivo application, especially since there are different transduction efficiencies as well as selectivity of astrocytic targeting in the adult rodent brain with further implications for therapeutic gene transfer.

Adenosina é um modulador típico da transmissão sináptica no sistema nervoso central (SNC); controla maioritariamente a transmissão excitatória através da acção coordenada dos receptores inibitórios A1 e excitatórios A2A e, apesar do seu papel fisiológico e patológico resultar da sua ação preponderantemente em neurónios, estão também presentes em astrócitos onde controlam a astrogliose, a proliferação, a morte celular, e a libertação de factores neurotróficos e interleucinas. Os astrócitos são as células da glia não neuronais mais prevalentes no cérebro e estão fisicamente associados às sinapses onde a reciprocidade da sinalização química permite o funcionamento íntegro dos circuitos neuronais, o que originou o conceito de sinapse tripartida. Os astrócitos são importantes mediadores da plasticidade sináptica uma vez que eliminam o glutamato extracelular através de transportadores de glutamato. Este facto reveste-se de particular relevo em situações de sobre-excitação anormal pelo glutamato caraterístico de lesões agudas no SNC bem como em diversas doenças neurodegenerativas. O grupo de Purinas demonstrou recentemente que a activação dos receptores A2A astrocitários diminui a captação de glutamato em condições fisiológicas e patológicas o que atesta capacidade dos receptores A2A astrocitários em controlar processos patológicos através da actividade dos transportadores de glutamato. Uma vez que a densidade de receptores A2A (A2AR) está anormalmente aumentada em diversas situações de dano cerebral, propomos agora a hipótese de que o bloqueio dos receptores A2A astrocitários se constitua como uma nova estratégia promissora para prevenir a sobre-excitação anormal do glutamato prevenindo assim as modificações bioquímicas, funcionais e comportamentais associadas. Por essa razão, validámos novas ferramentas para diminuir local e seletivamente a expressão de receptores A2A astrocitários e posteriormente comprovar a sua eficácia em condições fisiológicas e patológicas. Este trabalho foi executado em duas etapas: i) incorporou-se em um vector viral revestido com a glicoproteína G do vírus Mokola um RNA de interferência (shRNA) para diminuir a expressão astrocitária de A2AR e também um gene repórter, a proteína fluorescente verde (EGFP) para permitir a identificação das células infectadas; ii) testouse a eficiência de infeção do lentivírus e a sua selectividade para astrócitos quer in vitro (em culturas primárias) quer in vivo (por administração dos lentivírus em regiões particulares do cérebro, tais como o córtex pré-frontal, o estriado e o hipocampo) e avaliou-se a diminuição da densidade dos receptores A2A astrocitários mediada pelos shRNAs. Avaliou-se a difusão do vírus bem como a transdução celular através da colocalização por imunofluorescência do EGFP com marcadores de astrócitos (GFAP e vimentina) e de neurónios (NeuN). Este estudo demonstrou que o lentivirus revestido com a glicoproteína G do vírus Mokola contendo shA2AR é eficiente na infeção de astrócitos bem como na diminuição da densidade de A2AR in vitro. Uma vez que a eficiência de transdução bem como a seletividade para astrócitos destes vírus parece ser distinta em diferentes regiões do cérebro de roedor com implicações para a sua aplicabilidade terapêutica, a utilização desta estratégia deve ser ponderada.