Drug Encapsulation in Extracellular Vesicles for Age-related Macular Degeneration Treatment

Abstract

A degenerescência macular da idade (DMI), a principal causa de deficiência visual na população idosa (acima de 55 anos) de países desenvolvidos, é uma doença degenerativa da mácula, a área central da retina, que causa perda de visão central. É inicialmente caracterizado por uma acumulação de depósitos extracelulares, chamados drusa, entre o epitélio pigmentado da retina (EPR) e a membrana de Bruch. Com o tempo, a DMI pode evoluir para um de dois estados avançados conhecidos, geralmente descritos como DMI seca e exsudativa. O primeiro é frequentemente chamada de atrofia geográfica (AG) e é caracterizada pelo aparecimento de áreas atróficas na retina. Este último pode ser identificado pela formação de novos vasos da coroide, a causa de muitos problemas associados, incluindo a formação de fibrose sub-retiniana, responsável pela destruição das células retinianas. Atualmente, a DMI não tem cura e apenas alguns tratamentos podem ser usados para retardar a progressão da doença. Na verdade, o único tipo de DMI tratável é a DMI exsudativa, e as escolhas giram em torno da fotocoagulação a laser (quase obsoleta), da terapia anti-fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) e terapia fotodinâmica (PDT) (atualmente, não é usada na DMI). A terapia anti-VEGF é o tratamento mais utilizado e eficaz na DMI exsudativa, impedindo a formação de novos vasos da coroide, no entanto, o tratamento não é eficaz para fibrose sub-retiniana.A PDT é uma terapia baseada em três componentes não tóxicos: um fotossensibilizador (PS), oxigénio molecular (O2) e uma fonte de luz com comprimento de onda adequado (dependente do PS). Para o tratamento de DMI exsudativa, tem sido utilizada em combinação com terapia anti-VEGF. Além disso, estudos anteriores já recorreram à PDT para o tratamento de fibrose em cicatrizes da pele e glaucoma.Com base na capacidade intrínseca do exossoma na comunicação célula a célula, a encapsulação de um PS (um galacto-PS, ZnTPPF16(SGal)4), capaz de reconhecer o tecido doente, em exossomas poderia oferecer uma abordagem inovadora para a entrega do PS ao tecido fibroso e aos novos capilares da coroide presentes num caso de DMI. Neste trabalho, apresentamos um sistema de entrega de fármacos composto por uma zinco-porfirina conjugada com quatro moléculas de tiogalactose, ZnTPPF16(SGal)4, e exossomas, para atuar como veículo de fármacos, como uma potencial alternativa para o tratamento de fibrose em pacientes com DMI exsudativa. Este galactose-PS foi projetado para um alvo específico, nomeadamente proteínas com afinidade à galactose, galectinas, que são sobreexpressas na fibrose sub-retiniana e neovascularização coroideia (CNV) na DMI. Exossomas obtidos de olhos de suíno foram usados para veicular o PS. O ZnTPPF16(SGal)4 exossómico foi purificado e o seu conteúdo foi avaliado por microscopia eletrónica de transmissão (TEM) e fluorescência. A encapsulação/associação de ZnTPPF16(SGal)4 com exossomas usando banho de sonicação foi mais bem-sucedida do que recorrendo à sonicação com sonda. Foram avaliadas as propriedades fotofísicas do PS e seu potencial fotodinâmico na linhagem celular ARPE-19 (com morfologia reminiscente de fibroblastos) foi comparado com o do ZnTPPF16(SGal)4 exossómico. ZnTPPF16(SGal)4 livre e exossómico foi incorporado pelas células ARPE-19 em função da concentração de PS e do tempo utilizados. Ambos se revelaram não tóxicos até a ativação pela luz. A citotoxicidade induzida por PDT foi maior com ZnTPPF16(SGal)4 livre do que com ZnTPPF16(SGal)4 exossómico.Outro dos objetivos deste trabalho passou por estabelecer um modelo de indução de CNV por fotocoagulação a laser em ratinhos. Com base em estudos anteriores, usámos um laser verde a 532 nm para romper a membrana de Bruch de ratinhos C57BL/6J do tipo selvagem, induzindo assim a CNV. Os resultados mostraram que fomos capazes de estabelecer o modelo CNV, no qual as células adjacentes à monocamada RPE normal foram positivas para alpha-SMA e Ki67, sugerindo o desenvolvimento de fibrose neste modelo.Aqui demonstrámos que, após fotoativação, o ZnTPPF16(SGal)4 apresentou alta eficácia na indução de toxicidade em ARPE-19. A ausência de um aumento do efeito fotodinâmico esperado para o ZnTPPF16(SGal)4 exossómico pode estar relacionada com a origem dos exossomas, conforme demonstrado pela sua menor acumulação nessas células. A presença de CNV e tecido fibrótico, associada ao modelo de CNV em ratinhos, permitirá em breve testar a eficácia da PDT para fibrose sub-retiniana e CNV na DMI.

Age-related Macular Degeneration (AMD), the leading cause for visual impairment in the elder population (over 55 years old) of developed countries, is a degenerative disease of the macula, the central area of the retina, that causes central vision loss. It is initially characterized by an accumulation of extracellular deposits, called drusen, between the retinal pigment epithelium (RPE) and Bruch’s membrane. Over time, AMD can evolve to one of two known advanced states, usually described as dry and wet AMD. The former is often named geographic atrophy (GA) and is characterized by the appearance of atrophic areas in the retina. The latter can be identified by the formation of new choroidal vessels, the cause of many associated problems, including the formation of subretinal fibrosis, responsible for the destruction of retinal cells. Currently, AMD has no cure and just a few treatments can be used to slow the progression of the disease. In fact, the only type of treatable AMD is wet AMD, and the choices revolve around laser photocoagulation (almost obsolete), anti-vascular endothelial growth factor (VEGF) therapy, and photodynamic therapy (PDT) (currently, not used in AMD). Anti-VEGF therapy is the most used and effective treatment in wet AMD, stopping the formation of new vessels from choroid, however, this treatment is not effective for subretinal fibrosis.PDT is a therapy based on three non-toxic components: a photosensitizer (PS), molecular oxygen (O2), and a light source with adequate wavelength (dependent on the PS). It has been used in combination with anti-VEGF therapy for wet AMD treatment. Moreover, previous studies have utilized PDT for fibrosis treatment in skin scars and glaucoma. Based on exosome's intrinsic ability of cell-to-cell communication, the encapsulation of a PS (a galacto-PS, ZnTPPF16(SGal)4), with recognition for the diseased tissue, in exosomes could offer an innovative approach for delivering the payload to the fibrous tissue and new capillaries of the choroid in the case of AMD. In this work, we present a drug delivery system composed by a zinc-porphyrin conjugated with four thiogalactose molecules, ZnTPPF16(SGal)4, and exosomes, to act as drug carriers, as a potential alternative for PDT treatment of fibrosis in wet AMD patients. This galactose-PS was designed for a specific target, namely galactose-binding proteins, galectins that are overexpressed in subretinal fibrosis and choroidal neovascularization (CNV) in AMD. Exosomes obtained from porcine eyecups were used to load the PS. Exosomal ZnTPPF16(SGal)4 has been purified and the loading was evaluated by transmission electron microscopy (TEM) and fluorescence. In the sonication bath, ZnTPPF16(SGal)4 encapsulation/association with exosomes was more successful than in the probe sonication. We have assessed the photophysical properties of the PS and its photodynamic potential in ARPE-19 cell line (with morphology reminiscent of fibroblasts) was compared with exosomal ZnTPPF16(SGal)4. Free and exosomal ZnTPPF16(SGal)4 were found to be incorporated by ARPE-19 cells in a concentration and time-dependent manner. Both were non-toxic until activation by light. PDT-induced cytotoxicity was higher with ZnTPPF16(SGal)4 than exosomal ZnTPPF16(SGal)4. We also aimed to establish a CNV induction model by laser photocoagulation in mice. Based on previous studies, we used a green laser at 532 nm to rupture the Bruch’s membrane of wild-type C57BL/6J mice, thus inducing CNV. Results showed we were able to establish the CNV model, in which cells adjacent to the normal RPE monolayer were positive to alpha-SMA and Ki67, suggesting fibrosis development in this model.We have shown that after photoactivation, ZnTPPF16(SGal)4 showed high efficacy in inducing ARPE-19 toxicity. The lack of enhancement of photodynamic effect with exosomal ZnTPPF16(SGal)4 may be related to the source of exosomes, as demonstrated by its lower accumulation in these cells. The presence of CNV and associated fibrotic tissue in the CNV mice model will allow shortly to test the efficacy of PDT for subretinal fibrosis and CNV in AMD.