Acção antimicrobiana de sobrenadantes mistos S. cereviisiiae /H.. guilliermondii em leveduras não-Saccharomyces

Abstract

A primeira fase deste trabalho consistiu na caracterização do perfil de células viáveis e comportamento fermentativo dum cultivo misto de Saccharomyces cerevisiae (Sc) e Hanseniaspora guilliermondii (Hg) em condições enológicas de crescimento. A fermentação mista foi realizada em mosto sintético, que simula a composição química dos mostos de uva(200 g l-1 de glucose e frutose, pH=3,5), sem agitação nem arejamento, e o meio foi inoculado com uma densidade celular de cerca de 106 UFC ml-1 de cada uma das leveduras. O estudo mostrou que as duas leveduras cresceram durante o primeiro dia de cultivo, apresentando a levedura Hg uma diminuição da densidade celular a partir deste ponto e atingido a densidade celular de 5,0×102 UFC ml-1 aos 4 dias de fermentação; pelo contrário a levedura Sc manteve a viabilidade celular ao longo dos restantes dias de fermentação. Este comportamento foi comparado com o observado em fermentações simples de Hg e Sc, efectuadas nas mesmas condições de crescimento. Na fermentação simples a Hg apresentou uma densidade celular aos 4 dias de cultivo de 3,0×106 UFC ml-1 e na fermentação simples Sc, a levedura apresentou, por sua vez, um perfil de células viáveis idêntico ao do cultivo misto. O perfil de consumo de açúcares das leveduras em cultivos simples mostrou a natureza frutofílica de Hg e glicofílica de Sc. Para investigar o efeito inibitório da fracção proteica dos sobrenadantes mistos (Sc/Hg)sobre o crescimento da levedura Hg, fraccionaram-se e concentraram-se sobrenadantes,obtidos a partir de cultivos mistos (Sc/Hg) com 4 dias de fermentação, utilizando um sistema de ultrafiltração por membranas. As fracções concentradas (>2 kDa, >10 Kda e (2-10) kDa) foram adicionadas a mosto sintético modificado (MSmod) que foi formulado de modo a conter uma concentração inicial de açúcares (100 g l-1) e etanol (45 g l-1) semelhante à existente nos sobrenadantes mistos com 4 dias de fermentação (SM-4d). No cultivo efectuado no SM-4d a levedura Hg perdeu totalmente a sua viabilidade celular ao fim de 4-5 dias. Nos cultivos efectuados em MSmod verificou-se que a adição das fracções proteicas induziu uma inibição inicial do crescimento durante os primeiros 2 dias. Estes resultados confirmaram a existência de compostos proteicos nos sobrenadantes mistos (Sc/Hg) com acção antimicrobiana contra a levedura Hg. No entanto, comparando os perfis de células viáveis no SM-4d com os observados no MSmod contendo as fracções proteicas pode-se afirmar que para além destes compostos proteicos os sobrenadantes mistos contêm outras substâncias tóxicas que em conjunto com os inibidores proteicos serão responsáveis pelo efeito de morte observado nos SM-4d. Testou-se o efeito inibitório dos sobrenadantes mistos (Sc/Hg) sobre o crescimento de 6 estirpes de leveduras não-Saccharomyces associadas à microflora enológica: H.guilliermondii (Hg); H. uvarum (Hu), Kluyveromyces marxianus (Km), K. thermotolerans (Kt),Torulaspora delbrueckii (Td) e Zygosaccharomyces bailii (Zb). Para tal efectuaram-se cultivos de cada uma destas estirpes em SM-4d nas mesmas condições que as utilizadas anteriormente. Os resultados obtidos mostraram que o SM-4d induziu a morte de todas asleveduras à excepção da Zb que manteve a viabilidade celular durante 8 dias de cultivo. As taxas de morte das leveduras Hg, Hu, Km, Kt e Td, variaram entre a perda total de viabilidade celular ao fim de 3 dias para a levedura Hu e ao fim de 5-7 dias para as leveduras Hg, Kt e Td. Finalmente, para investigar se a morte das leveduras não-Saccharomyces observada nos cultivos efectuados nos SM-4d poderia também estar relacionada com a fracção proteica dos mesmos, efectuaram-se cultivos das leveduras Km, Kt e Td em mosto sintético modificado (100 g l-1 de açúcares, 60 g l-1 de etanol e 0,6 g l-1 de ácido acético). Verificou-se que todas as leveduras estudadas (Km, Kt e Td), embora sofrendo uma inibição inicial,foram capazes de crescer no referido meio o que significa que nem o etanol, nem o ácido acético podem explicar a morte observada no SM-4d. A adição das fracções proteicas ao mosto sintético modificado provocou, embora com intensidades diferenciadas, um efeito de inibição em todas as leveduras, tendo sido mais acentuada na levedura Km do que nas leveduras Kt e Td. De todos os resultados obtidos no presente trabalho, pode-se concluir que o desaparecimento prematuro de muitas leveduras não-Saccharomyces durante fermentações vinárias não resulta primeiramente do etanol existente no meio mas sim de outros compostos tóxicos produzidos pela Sc, nomeadamente de substâncias proteicas com acção antimicrobiana contra muitas destas espécies.