Identificação Molecular de Candidoses invasivas no Centro Hospitalar Cova da Beira, E.P.E Métodos Convencionais vs. Métodos Moleculares

Abstract

As leveduras são fungos oportunistas responsáveis pela maior parte das infecções fúngicas nos seres humanos. Este tipo de infecções é mais comum em indivíduos com o sistema imunitário comprometido e têm vindo a aumentar ao longo dos anos. A espécie Candida albicans é a mais frequentemente identificada, como sendo responsável por este tipo de infecções, no entanto, o número de infecções provocadas por outras espécies do género Candida ocorre cada vez com mais frequência. As infecções hospitalares fúngicas constituem uma causa crescente de morbilidade e mortalidade em hospitais, afectando tanto doentes internados, como profissionais de saúde. Do ponto de vista etiológico, a grande maioria das infecções fúngicas hospitalares é causada por espécies do género Candida, principalmente Candida albicans, C. parapsilosis, C. tropicalis e C.glabrata. A sua identificação taxonómica, geralmente exige o seu isolamento inicial em meios de cultura, a realização de provas bioquímicas de assimilação in vitro, com a utilização de “kits” comerciais, ou a sua repicagem para meios cromogénios. O principal objectivo deste trabalho foi a identificação rápida e eficaz de candidoses invasivas através de uma metodologia molecular de diagnóstico que fosse simples e fácil de implementar em laboratórios de diagnóstico microbiológico. Para tal, foram seleccionados 100 isolados clínicos de leveduras obtidas a partir de amostras clínicas enviadas para o Laboratório de Patologia Clínica do Centro Hospitalar Cova da Beira E.P.E. para o diagnóstico laboratorial de infecção fúngica durante um período de 8 meses, desde Novembro de 2008 até Junho de 2009. O trabalho baseou-se na identificação molecular por PCR-RFLP de espécies do género Candida, e os resultados foram comparados com os obtidos pelos métodos de diagnóstico tradicionais (CHROMagar® Candida e VITEK® - bioMérieux) utilizados no laboratório hospitalar. Foi ainda efectuado o estudo da sensibilidade in vitro de espécies do género Candida aos antifúngicos fluconazol, voriconazol, através dos métodos, de difusão em disco e E-Test®, segundo os procedimentos padronizados e publicados pelo CLSI, tendo-se verificado elevada sensibilidade dos isolados para ambos os fármacos. Com este trabalho concluiu-se que a eficiente e rápida identificação dos fungos clinicamente relevantes por parte dos laboratórios de patologia clínica deve ser uma tarefa fundamental para o controle das infecções. A identificação ao nível da espécie é importante para determinar a etiologia da infecção, para detectar novos agentes da doença, para prever resistências intrínsecas a agentes antifúngicos e para detectar causas de infecções nosocomiais. Face ao exposto, os estudos epidemiológicos são de extrema importância, assim como o diagnóstico das infecções fúngicas. O diagnóstico das infecções fúngicas continua a ser efectuado por métodos tradicionais, que avaliam características fisiológicas e bioquímicas dos elementos fúngicos, mas que apesar de serem eficazes são, na sua maioria, demoradas impedindo um início rápido e atempado da terapêutica. Como tal, os métodos moleculares podem constituir uma alternativa mais viável ao diagnóstico micológico, nomeadamente de leveduras do género Candida, como se pode comprovar pelos resultados obtidos neste trabalho.

Yeasts are fungi responsible for the major part of fungal infections that affect human beings. This type of infection is common in individuals with compromised immune system and has increased in number along the years. Candida albicans is the most frequently identified species responsible for this type of infection. However, the number of infections caused by other Candida species occurs every-time more frequently. Nosocomial fungi-related infections are one growing cause of morbidity and death in hospital settings, and they commonly affect both patients and health professionals. From the etiologic point of view, the big majority of fungi-related nosocomial infections are also caused by species of Candida, mainly Candida albicans, C. parapsilosis, C. tropicalis e C. glabrata. Taxonomical identification usually implies their initial isolation in culture media followed by submission to in vitro assimilation biochemical techniques (using commercial kits) or growth in chromogenic media. The major goal underlying this work was the molecular identification of invasive candidoses through fast but yet powerful molecular diagnostic techniques. The chosen technique should be easy to implement in medical microbiology laboratories. We randomly selected 100 yeast infected samples previously submitted to the Clinical Pathology laboratory at the “Centro Hospitalar Cova da Beira E.P.E” for diagnosis. The samples were collected along the time during a span of 8 months (from November 2008 to July 2009). Our work was based on the molecular identification of species of Candida species via PCR followed by RFLP analysis and comparison of our results to those from conventional methodologies used for diagnosis (CHROMagar® Candida and VITEK® - bioMérieux).We have also performed an in vitro sensitivity assay of species of Candida towards Fluconazol and Voriconazol, two commonly used antifungal drugs. This study was performed using the standard methodologies (disk-diffusion and E-Test®) as published by the CLSI. Finally we verified high sensitivity of all samples towards both drugs. We concluded that rapid but reliable identification of clinically-significant fungi is a fundamental task for clinical pathology laboratories. Identification to the species level it is important for: a) the etiological determination of the disease, b) to detect new disease-causing agents, c) to predict intrinsic resistance towards antifungal drugs, d) to determine the cause of nosocomial infections. Based on all the above we can say that the epidemiological studies and the diagnosis of fungal infections are of extreme importance. Currently, diagnosis is performed using conventional methods that evaluate the biochemical and physiological characteristics of fungi-derived elements. These methodologies are very efficient for their identification purpose but generally slow, delaying the start of therapeutics. As demonstrated by our results, molecular-based methodologies constitute an alternative for the fast but sensitive diagnostics of infections caused by yeast, mainly by Candida species.