3차원 배양 기질 특성이 RAW264.7 세포의 구조, 증식 및 분화거동에 미치는 영향

Abstract

본 연구에서는 티올-노보닌 클릭광중합법(thiol-norborn-ene photo-click polymerization)을 이용하여 폴리에틸렌글리콜 (poly(ethylene glycol), PEG) 기반의 삼차원 세포 배양 기질을 제조하고, 대식세포의 한 종류인 RAW264.7을 캡슐 레이션하여 생리학적 거동을 살펴보고자 하였다. 이 때 하이드로젤의 분해성, 생활성 분자(콜라겐Ⅰ), 전단저장탄성율(G')을 조절하였으며 제조한 하이드로젤에 캡슐레이션된 RAW264.7 세포의 배양 1일차 Live/Dead 형광염색 결과를 통해 모든 조건에서 70-80% 이상의 초기 세포 생존율을 보임을 확인하였다. 기질의 분해성은 세포가 분비하는 여러 가지 단백질 분해효소에 의해 분해되는 펩타이드 가교제를 사용하여 조절하였다. 기질을 재구축 하는데 필요한 단백질 분해효소(MMP9, MMP14, CatK)의 발현양을 유전자 수준에서 관찰하여 2차원 TCP에 배양한 세포에 비해 3차원 하이드로젤 내에 캡슐레이션 하였을 때 발현양이 증가함을 확인 하였다. 또한 생활성 성분인 콜라겐Ⅰ의 첨가는 배양 시간에 따른 세포회합체의 크기 증가에 영향을 다소 미치는 것을 알 수 있었다. 콜라겐 고정화 유무가 염증성 사이토카인(iNOS, COX2, TNF-α)의 발현에는 영향을 미치지 않았지만, 2차원 TCP에 배양한 경우보다 하이드로젤에 캡슐레이션된 세포에서 발현양이 4배이상 증가하는 것으로 보아 2차원 배양과는 다른 거동을 보임을 확인 하였다. 마지막으로 하이드로젤의 전단저장탄성율은 가교제의 농도 를 조절하여 가교밀도를 달리함으로써 조절하였다. 이 때 기질 분해 성에 의한 영향도 함께 살펴보기 위해 각각 MMP 비민감성 가교제 와 MMP 민감성 가교제를 이용하여 하이드로젤을 제조하였다. 하이드로젤에 캡슐레이션된 RAW264.7 세포의 증식과 형태, 분화능은 기질의 분해성보다는 탄성율에 더 큰 영향을 받음을 확인할 수 있었다. 기질의 분해성에 관계없이 탄성율이 낮은 하이드로젤에서 세포의 대사활성이 더 높게 나타나며 세포회합체도 보다 크게 형성함을 확인하였다. 염증성 사이토카인 발현양의 경우 2차원 TCP 대비 3차원 하이드로젤 내에 캡슐레이션된 세포에서, 그리고 분해성에 관계없이 High G' 하이드로젤에서 발현양이 증가 함을 알 수 있었다. 이를 통해 다양한 삼차원 환경에서의 대식세포 의 생리학적 거동을 예측할 수 있고, PEG 기반의 하이드로젤이 대식세포의 배양 플랫폼으로 적합함을 확인하였다