Spatially-resolved Laser Activated Cell Sorting for Genomics and Transcriptomics in Biological Specimens

Abstract

In this dissertation, Spatially-resolved Laser Activated Cell Sorting (SLACS) technique is introduced, and its applications in genomics and transcriptomics are demonstrated. All biological mass is comprised of biological cells, each of which contain its own multi-billion bytes worth of data from genetic molecules, such as DNA or RNA. After the Human Genome Project sequenced one persons genome in ten years, the massively parallel sequencing technologies that are referred to the next generation sequencing (NGS) sprouted innovations in biology, providing further insights into biology and generating revolutions in diagnostics and therapeutics. However, these technologies were only applicable to pools of heterogeneous genetic molecules, hindering thorough explorations of genetic landscapes in the different cells within a biospecimen. Therefore, efforts to separate each and every cell from the pool of cells have generated numerous single cell isolation methodologies, which can be categorized into three: those that separate cell using microfluidics, microarrays, and optics. Advancement in micro-technologies particularly provided advantages in manipulating single cells because biological cell sizes that usually range from microns to tens of microns. State-of-art cell separation technologies that utilize microfluidic properties were rapidly commercialized, enabling high throughput single cell analysis that can process hundreds to thousands of single cells at a time. These utilize cell dissociation and compartmentalization in a microfluidic chambers or a pico-liter droplets, in which biomolecular techniques can amplify the desired genetic molecules. The amplified products such as the genomes or the transcriptomes of the single cells are sequenced through NGS, providing insights into how the dissociated cells were functioning in the biospecimen. However, the dissociation process of the cells that are originally adhered to each other can be harsh and requires the surface proteins that interact with another to be degraded. This process has raised many doubts on whether the cell state is the same before it is dissociated within a solvent. Therefore, microarrays of chemically synthesized oligonucleotides that can capture the poly adenosine tail, or poly (A) tail, were developed to capture the messenger RNAs (mRNAs) directly from the biological specimens. These technologies, however, require large resolution of the oligonucleotide spots because of the technical limitations in chemical DNA synthesis technologies and cross-contaminations between the spots. Optical separation of the cells from biospecimen has been extensively investigated with conventional laser capture microdissection (LCM) devices that utilize laser to transfer target area of interest to the desired receiver. However, these utilize either ultraviolet (UV) lasers to catapult the desired areas that can be highly damaging to the biomolecules within, or thermoplastics that can be melt down using near-infrared (IR) lasers and transfer the desired region of interest for further biological assays. However the thermoplastic approach often cause cross-contamination and has low throughput because the specimen has to be isolated in a contact manner. In this dissertation, the development of an optical cell sorter, or spatially-resolved laser activated cell sorter (SLACS) that uses pulsed near-IR laser that can optomechanically isolate the cells with low damage and high throughput is described. The engineering process of this novel device and two softwares and their applications in NGS technologies are described. Furthermore, the applications of SLACS for genomics and transcriptomics are demonstrated. Proof-of-concept studies for future applications of SLACS are also described.

본 학위 논문에서는 이 논문에서는 SLACS (Spatially-resolved Laser Activated Cell Sorting) 기술이 도입되었으며 유전체학 및 전사체학에 대한 응용이 시연되었다. 모든 생물학적 덩어리는 생물학적 세포로 구성되며, 각각의 세포는 DNA 또는 RNA와 같은 유전자 분자로부터 얻은 수십억 바이트의 데이터를 포함한다. 휴먼 게놈 프로젝트가 10 년 안에 한 사람의 게놈을 시퀀싱 한 후, 차세대 시퀀싱 (NGS)과 관련되는 대규모 병렬 시퀀싱 기술은 생물학의 혁신을 불러 일으켜 생물학에 대한 통찰력을 제공하고 진단 및 치료에서 혁명을 일으켰다. 그러나 이 기술들은 이종 유전자 분자의 풀에만 적용 할 수 있으며, 생물 표본 내의 다른 세포에서 유전자 지형의 철저한 탐색을 방해하였다. 따라서, 세포 풀에서 각각의 모든 세포를 따로 분리하려는 노력은 수많은 단일 세포 분리 방법론을 생성하였으며, 이는 미세유체학, 마이크로 어레이 및 광학을 사용하여 세포를 분리하는 것의 세 가지로 분류 될 수 있다. 일반적으로 수 마이크로미터에서 수십 마이크로미터에 이르는 생물학적 세포 크기 때문에 단일 기술의 진보는 단일 세포 조작에 이점을 제공 하였다. 미세 유체 특성을 이용하는 최첨단 세포 분리 기술이 빠르게 상용화되어 한 번에 수백에서 수천 개의 단일 세포를 처리 할 수 있는 고 처리량 단일 세포 분석이 가능해졌습니다. 이들은 미세 분자 챔버 또는 피코 리터 액적에서 세포 해리 및 구획화를 이용하며, 여기서 생체 분자 기술은 원하는 유전자 분자를 증폭시킬 수 있다. 단일 세포의 게놈 또는 전 사체와 같은 증폭 된 생성물은 NGS를 통해 시퀀싱되어, 해리 된 세포가 생체 시편에서 어떻게 기능하는지에 대한 통찰력을 제공한다. 그러나, 원래 서로 부착 된 세포의 해리 과정은 가혹할 수 있으며, 서로 상호 작용하는 표면 단백질이 분해 될 것을 요구한다. 이 공정은 전지 상태가 용매 내에서 해리되기 전에 동일한 지에 대해 많은 의문을 제기했다. 따라서, 폴리아데노신 꼬리 또는 폴리 (A) 꼬리를 포획 할 수 있는 화학적으로 합성 된 올리고 뉴클레오티드의 마이크로 어레이는 생물학적 표본으로부터 메신저 RNA (mRNA)를 직접 포획하기 위해 개발되었다. 그러나, 이들 기술은 화학적 DNA 합성 기술의 기술적 한계 및 스폿 간의 교차 오염으로 인해 올리고 뉴클레오티드 스폿의 큰 해상도를 요구한다. 생체 시료로부터 세포의 광학적 분리는 관심 대상 영역을 원하는 수신기로 전달하기 위해 레이저를 이용하는 종래의 레이저 캡처 미세 해부 (LCM) 장치로 광범위하게 조사되었다. 그러나, 이들은 자외선 (UV) 레이저를 사용하여 생체 내 분자에 크게 손상을 줄 수있는 원하는 영역을 만들거나 근적외선 (IR) 레이저를 사용하여 녹일 수 있고 추가 생물학적 물질을 위해 원하는 관심 영역을 전달할 수있는 열가소성 수지를 사용한다. 분석. 그러나 열가소성 방식은 종종 교차 오염을 유발하고 시편을 접촉 방식으로 분리해야하기 때문에 처리량이 낮다. 이 논문에서는 광학 셀 분류기 또는 낮은 손상과 높은 처리량으로 셀을 광학적으로 분리 할 수 있는 펄스 형 근적외선 레이저를 사용하는 SLACS (공간적으로 해결 된 레이저 활성화 셀 분류기)의 개발에 대해 설명하였다. 이 새로운 장치의 엔지니어링 프로세스와 NGS 기술의 두 소프트웨어 및 응용 프로그램에 대해 설명하였다. 또한, 게놈 및 전 사체에 대한 SLACS의 적용이 입증되었다. SLACS의 향후 응용에 대한 개념 증명 연구도 설명하였다.