Production and characterization of hydrophobins wirh potential for oral medicine applications

Abstract

Hidrofobinas são proteínas produzidas apenas por fungos (Ascomycetes e Basidiomycetes) que são capazes de se auto-organizar numa membrana anfipática, na interface, alterando assim a natureza das superfícies. Embora as hidrofobinas de diferentes espécies possuam baixa homologia de sequência, apresentam padrões de hidropatia aproximados, são ricos em cisteína e podem ser distinguidos em duas classes: classe I e classe II. O objectivo geral deste estudo inclui a produção e caracterização de hidrofobinas com potencial uso na medicina oral. Três estirpes, isolados fúngicos L7 e C1.1 da coleção do laboratório, e Bjerkandera sp. BOS55 (L3), também da coleção de laboratório, foram testados a partir da produção de hidrofobinas. A amplificação e sequenciação da zona ITS fúngica permitiram a identificação das espécies L7 e C1.1 isoladas, respectivamente, Mucor circinelloides e Hypocrea lixii (Trichoderma harzianum). As hidrofobinas a partir das três estirpes, foram produzidas, extraídas e ainda caracterizadas. Para a caracterização bioquímica, foi testado o fluido extracelular de todos os isolados para a estabilidade da espuma e o teste de espalhamento de óleo e de tensão superficial. Para todos os isolados a avaliação da hidrofobicidade de conídios foi realizada por suspensão do mesmos e a molhabilidade do micélio foi testada na superfície das hifas. O fluido extracelular do isolado Hypocrea lixii (Trichoderma harzianum) obteve melhor desempenho do que os outros, e também apresentou o micélio mais impermeável, evidenciado no ensaio de molhabilidade da superfície. O Mucor circinelloides foi aquele que exibiu os conídios mais hidrofóbicos. Observações no SEM parecem indicar que todos os isolados possuem hidrofobinas de superfície classe I. Todas as misturas de hidrofobinas obtidas apresentaram alguma atividade antimicrobiana, bem como eficácia na inibição da formação de biofilme de Candida albicans. A caracterização da mistura de hidrofobinas concentradas por HPLC evidenciou dois picos com características hidrofóbicas os quais serão caracterizados em trabalhos futuros. Assim, foi possível isolar hidrofobinas com eficácia na proteção de adesão e crescimento de microrganismos, demonstrando potencial de aplicação na saúde oral.

Hydrophobins are proteins produced only by fungi (Ascomycetes and Basidiomycetes) that are able to self-assemble into an amphipatic membrane at an interface thus changing the nature of surfaces. Although hydrophobins from different species have low sequence homology, they present approximate hydrophaty patterns, are rich in cysteine and can be distinguished in two classes, class I and class II. The general objective of this research was the production and characterization of hydrophobins with potential use in oral medicine. Three strains, fungal isolates L7 and C1.1 from the laboratory collection and Bjerkandera sp. BOS55 (L3) also from the laboratory collection were tested for hydrophobin production. Fungal ITS amplification and sequencing allowed the identification to species of L7 and C1.1 isolates, respectively, Mucor circinelloides and Hypocrea lixii (Trichoderma harzianum). Hydrophobins from all three strains were produced, extracted and further characterized. For biochemical characterization of all three isolates, the extracellular fluid of all isolates was tested for foam stability, oil spreading assay and surface tension. The assessment of conidial hydrophobicity was performed for conidial suspension and mycelium wettability was tested in surface hyphae. Extracellular fluid of isolate Hypocrea lixii (Trichoderma harzianum) showed better performance than the others, and also presented the most impermeable mycelia, as observed by surface wettability assay. Mucor circinelloides presented the most hydrophobic conidia. SEM observations seem to indicate that all three isolates possess class I surface hydrophobins. All hydrophobin mixtures obtained presented antimicrobial, as well as efficient inhibition of biofilm formation by Candida albicans. The characterization of concentrated hydrophobin mixtures by HPLC showed two peaks with hydrophobic characteristics, which will be characterized in future studies. So, within this work was possible to isolate hydrophobins with efficacy on the protection of biofilm formation and inhibition of microbial growth, demonstrating a potential for oral medicine applications.