Utilize este identificador para referenciar este registo: http://hdl.handle.net/10400.6/10314
Título: Role of astrocytes in an in vitro model of ischemic stroke
Autor: Roque, Cláudio André Martins
Orientador: Baltazar, Graça Maria Fernandes
Palavras-chave: Acidente vascular cerebral isquémico - Recuperação de lesões - Estrogénio
Acidente vascular cerebral isquémico - Recuperação de lesões - Estimuçação magnética repetitiva de alta frequência
Acidente vascular cerebral isquémico - Recuperação de lesões - Astrócitos
Data de Defesa: 7-Fev-2020
Resumo: Ischemic stroke (IS) is the leading cause of complex and serious long-term disability in developed countries, and after decades of effort there are no effective clinical treatments for IS, especially in the subacute and chronic phases. Currently, in these stages of the IS there is no alternative to promote the recovery of brain tissues affected by the ischemic injury. Most of the treatments (e.g., physical therapy, speech therapy, occupational therapy) are applied with the aim of reducing the sequelae left, or to controlling modifiable risk factors (e.g., hypertension, diabetes, coagulopathies). This leads to a need to develop new approaches to recover those areas, reduce the neurological deficits and, if possible, enhance the functions regulated by the affected brain regions. In this context, this work intends to explore two approaches that hypothetically could induce the recovery of the areas affected by ischemia. The first is related to the potent physiological effects of estrogens on central nervous system (CNS) and its participation in several processes such as, neurogenesis, the expression of neuroprotective factors and antioxidant mechanisms, through the evaluation of the potential beneficial effects induced by the selective activation of G protein–coupled estrogen receptor 1 (GPER or GPR30). The second, by evaluating the potential protective effects induced by high frequency repetitive magnetic stimulation (HF-rMS), an approach that has been described as having the ability to correct maladaptive brain plasticity and to enhance neuronal communication during rehabilitation. In both cases the ability to induce neuroprotection in neurodegenerative disorders, such as, Alzheimer´s disease, Parkinson’s disease, and mood disorders, was already demonstrated. To standardize the ischemic damage and evaluate the potential beneficial effects induced by these two approaches several in vitro models of ischemia were developed and characterized. Neuron-enriched, neuron-glia, and astrocyte-enriched primary cortical cultures subjected to oxygen and glucose deprivation (OGD) followed by a reperfusion period, were used as models. The evaluation of the effects induced by GPER activation and by HF-rMS was performed through the assessment of several parameters related cell survival and proliferation, GPER expression, calcium imaging, as well as neurite morphometric and synaptic modifications. Concerning the role of GPER on the ischemic injury, we observe that ischemia did not change the levels of GPER in neurons and astrocytes. Moreover, GPER selective activation had no impact in neuronal survival, whereas it induced the apoptosis of astrocytes, being this effect meditated by the activation of phospholipase C pathway, and the subsequent intracellular calcium rise. These data indicate a direct impact of GPER on the viability of astrocytes, and the coupling of GPER to different signaling pathways in astrocytes and neurons. Our data also shows that HF-rMS reduces the neuronal loss, the initial neurite degeneration and the loss of synaptic markers triggered by ischemia. Interestingly the protective effect triggered by HF-rMS required the presence of astrocytes. Taken together the data obtained suggests that HF-rTMS has the potential to be used as a therapeutic approach to reduce neuronal death and neuronal damage, by limiting neurite degeneration and enhance functional connectivity and synaptic plasticity in the areas affected by the ischemia. Furthermore, our results also suggest that astrocytes play a crucial role on ischemic injury. Astrocytes were more resistant to ischemic periods than neurons in all experiments performed and when they were present the injury was smaller, which indicate an active role in the neuronal protection against ischemia-induced injury. Taking into account their preponderant role in neuronal physiology and the fact that their presence is crucial for the observed beneficial effects induced by HF-rMS it seems evident that astrocytes could have a substantial impact on the protection and recovery of ischemia-induced lesion. Thereby, we hypothesize that astrocytes could be a potential therapeutic target for the treatment of cerebral ischemia and any methodology/approach that potentiate their beneficial effects may be a promising therapeutic approach.
O Acidente vascular cerebral isquémico representa uma das principais causas de incapacidade em países desenvolvidos, e mesmo após décadas de investigação ainda não existem abordagens terapêuticas eficazes, especialmente nas fases subaguda e crónica da doença. Atualmente, nestes estadios da patologia, não existe uma alternativa que promova a recuperação dos tecidos cerebrais que foram afetados pela isquemia. A maior parte dos tratamentos (fisioterapia, terapia da fala, terapia ocupacional, etc.) são aplicados com o objetivo de reduzir as sequelas ou de controlar os fatores de risco modificáveis (hipertensão, diabetes, coagulopatias, etc.). O que leva a que exista uma necessidade de desenvolver novas abordagens que possibilitem a recuperação desses tecidos, diminuam os défices neuronais e, se possível, promovam a melhoria das funções que são reguladas pelas regiões cerebrais afetadas. Tendo isto em consideração, este trabalho tem como principal objetivo explorar a ação de duas abordagens distintas na recuperação de lesões isquémicas. A primeira está relacionada com os potentes efeitos fisiológicos do estrogénio no sistema nervoso central e a sua participação em diversos processos como a neurogénese, promoção da expressão de fatores neuroprotetores e ativação de mecanismos antioxidantes, mais precisamente através da avaliação dos potenciais efeitos benéficos induzidos pela ativação seletiva do recetor de estrogénio acoplado à proteína G (GPER). A segunda será através da avaliação dos efeitos induzidos pela estimulação magnética repetitiva de alta frequência (HF-rMS), uma abordagem que já foi descrita como tendo a capacidade de corrigir distúrbios ao nível da neurotransmissão e de melhorar a comunicação neuronal durante o processo de recuperação. Ambas as abordagens já foram descritas como tendo a capacidade de induzir neuroprotecção em patologias neurodegenerativos, como é o caso das doenças de Alzheimer e Parkinson e de perturbações de humor. De forma a padronizar a lesão isquémica e avaliar os efeitos induzidos por estas duas abordagens, vários modelos in vitro foram desenvolvidos e caracterizados. Foram utilizados três tipos de culturas primárias do córtex (cultura de astrócitos, cultura de neurónios e cultura de neurónios e células gliais), as quais foram submetidas à privação de oxigénio e glucose, seguindo-se um período de reperfusão. A avaliação dos efeitos induzidos por estas duas abordagens foi feita através de vários parâmetros relacionados com a sobrevivência e proliferação celular, avaliação do cálcio intracelular, assim como da análise morfométrica das neurites e de modificações sinápticas. Em relação ao papel do GPER na lesão isquémica, observamos que a privação de oxigénio e glucose não alterou os níveis de expressão deste recetor, nem em neurónios nem em astrócitos. A ativação seletiva do GPER não teve impacto na sobrevivência neuronal mas promoveu a morte astrocitária através de um mecanismo que envolve a ativação da via da fosfolipase C e o subsequente aumento dos níveis de cálcio intracelular. Estes dados mostram um impacto direto do GPER na viabilidade dos astrócitos e que a ativação do GPER está associada a diferentes vias de sinalização em astrócitos e neurónios. Os nossos resultados indicam também a HF-rMS reduz alguns dos efeitos negativos desencadeados pela lesão isquémica, tais como a morte neuronal, a degeneração inicial das neurites e a diminuição de marcadores sinápticos. Curiosamente, o efeito protetor da HF-rMS apenas é observável na presença de astrócitos. Estes dados sugerem que a HF-rTMS tem potencial para poder ser utilizada como uma abordagem terapêutica para reduzir a morte neuronal e os danos neuronais, limitando a degeneração das neurites e melhorando a conectividade funcional e a plasticidade sináptica nas áreas afetadas pela isquemia. Os nossos resultados sugerem também que os astrócitos desempenham um papel crucial na lesão isquémica. Para além de serem mais resistentes a períodos de isquemia do que os neurónios, todos os dados experimentais obtidos mostraram que quando os astrócitos estavam presentes a lesão foi menor, o que indica um papel ativo na proteção neuronal contra a lesão induzida pela isquemia. Tendo em consideração o seu papel preponderante na fisiologia neuronal e o fato de a sua presença ser obrigatória para os efeitos benéficos induzidos pela HF-rMS, parece evidente que os astrócitos podem ter um impacto substancial na proteção e recuperação da lesão induzida por isquemia. Como tal os astrócitos devem ser encarados como potenciais alvos terapêuticos para o tratamento da isquemia cerebral e qualquer metodologia/abordagem que potencialize os seus efeitos protetores pode ser uma abordagem terapêutica bastante promissora.
URI: http://hdl.handle.net/10400.6/10314
Designação: Doutoramento em Biomedicina
Aparece nas colecções:FCS - DCM | Dissertações de Mestrado e Teses de Doutoramento

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