Production and Purification of pre-miRNA-149 with potential application in diagnosis of prostate cancer

Abstract

A few years ago, was discovered that the lin-4 gene did not encode a protein, but a small RNA, responsible for regulating the expression of the LIN-14 protein in Caenorhabditis elegans. This promotes the study of a new class of biomolecules, the non-coding RNAs (ncRNAs), which include the microRNAs (miRNAs). Among them, the miRNA-149 is particularly relevant in the several cellular processes, including oncogenic regulators. Another particularity of this molecule is that the precursor (pre-miRNA-149) have a G-rich sequence, which forms a special nucleic acid secondary structure called G-quadruplex (G4) with a parallel topology that allows its recognition by nucleolin (an important nucleolar protein). This structure has been associated to the regulation of many cellular processes, such as, telomere maintenance, replication, transcription and translation. The present work describes the production and purification of pre-miRNA-149 in E. coli DH5a. For that purpose, a pre-miRNA-149 DNA sequence was cloned into a pBHSR1-RM plasmid and inserted within the previous competent cells by thermic shock. After fermentation, total RNA was and purified by affinity chromatography taking advantage of the biological recognition of pre-miRNA-149. Three affinity supports are used such as naphthalene amine Sepharose, Ltyrosine Sepharose and L-lysine Sepharose. Each of them has already been successfully used to purify similar biomolecules. The eluted fractions are evaluated by denaturing PAGE. The complete isolation of pre-miRNA-149 was not achieved in the three supports tested; however, some promising results were obtained with the L-lysine support, where a small portion of pre-miRNA-149 was isolated into one single fraction (low recovery rate), with a decreasing stepwise gradient from 2.05 M to 0.1 M of (NH4)2SO4 in Tris 10 mM (pH 6.0). Future affinity chromatography experiments are required to optimize the conditions to separate the pre-miRNA-149 from the total RNA mixture, to successfully use miRNA-based therapies.

Há alguns anos, descobriu-se que o gene lin-4 não codificava uma proteína, mas um pequeno RNA, responsável por regular a expressão da proteína LIN-14 em Caenorhabditis elegans. Deste modo, uma nova classe de biomoléculas emerge, os RNAs não-codificantes (ncRNAs), que incluem os microRNAs (miRNAs). Entre eles, o miRNA-149 é particularmente relevante em diversos processos celulares, incluindo os reguladores oncogénicos. Outra particularidade desta molécula é que o seu precursor (pre-miRNA-149) possui uma sequência rica em nucleótidos de guanina, que forma uma estrutura secundária denominada de G-quadruplex (G4), com topologia paralela que permite o seu reconhecimento pela proteína nucleolina. A estrutura de G4 tem sido associada à regulação de muitos processos celulares, como manutenção, replicação, transcrição e tradução de telómeros. O presente trabalho descreve a produção e purificação de pre-miRNA-149 em E. coli DH5a. Para esse propósito, uma sequência de DNA pre-miRNA-149 foi clonada em um plasmídeo pBHSR1-RM e inserida nas células competentes por choque térmico. Após a fermentação, o RNA total foi purificado por cromatografia de afinidade, aproveitando o reconhecimento biológico do pre-miRNA-149. Utilizam-se três suportes cromatográficos de afinidade que foram naftaleno amina Sepharose, L-tirosina Sepharose e L-lisina Sepharose. Cada um deles já foi usado com sucesso para purificar biomoléculas similares. As frações eluídas foram avaliadas por PAGE desnaturante. O isolamento completo do pre-miRNA-149 não foi alcançado em nenhum dos suportes; no entanto, foram obtidos alguns resultados promissores com o suporte de L-lisina, onde uma pequena porção de pre-miRNA-149 foi isolada num passo único, com gradiente decrescente de 2,05 M a 0,1 M de (NH4)2SO4 em Tris 10 mM (pH 6,0). Como trabalho futuro pretende-se otimizar as condições cromatográficas experimentais que permitam separar o pre-miRNA-149 da mistura de RNA total, para ser utilizado em terapias baseadas em miRNA.