Sexual steroid regulation of spermatogenesis: new actors enter the stage

Abstract

Spermatogenesis, the process of male gamete (i.e. spermatozoa) production, requires tight hormonal regulation in order to proceed successfully. The importance of androgens (like testosterone and 5α-dihydrotestosterone) to the regulation of spermatogenesis is well recognized. However, more recently, the importance of estrogens (like 17β-estradiol), has also been demonstrated. These sexual steroids act through ligand-activated transcription factors, estrogen receptors α and β (ERα and ERβ) and androgen receptor (AR), respectively. Most actions of these hormones are achieved through the regulation of target genes. The two ERs have different and sometimes opposing effects on the regulation of target genes, and estrogenic action will ultimately depend on interplay between them, when co-expressed in the same cell. The expression of ERα and ERβ in human testis has been strongly debated and a definite answer to whether only ERβ or both ERs are expressed is pivotal to understanding the estrogenic actions in human spermatogenesis. Several splice variants for ERα and ERβ have been described in testis, playing important roles in the regulation of their prototype receptors. In contrast, only one AR variant has been described so far in human testis, although the existence of more variants responsible for regulatory and non-classical actions is highly expected. The definition of the estrogen and androgen regulated transcriptome is of pivotal importance to understand the precise roles of sexual steroid hormones in testis. The main objectives of this thesis were to clarify the expression of ERα and ERβ in human testis, search for alternatively spliced AR variants, and to identify and characterize novel estrogen and androgen regulated genes with a potential importance in the control of spermatogenesis. The results presented herein demonstrate unequivocally that both ERα and ERβ are expressed in human testis, and clarify their cellular distribution. The existence of alternatively spliced testicular AR variants was confirmed with detection of four new AR forms in human testis, two of them conserved along the vertebrate evolutive line indicating a relevant functional importance. Conserning the sex steroid regulated transcriptome, two novel genes were identified, one regulated by estrogens and the other by androgens. Apoptosis inhibitor and modulator of DNA-damage response Aven was identified as a novel estrogen target gene in testis. Its expression was for the first time characterized in human and rat testis, as well as its cellular distribution to Sertoli and germ cells. Perhaps more importantly, it was shown that the expression levels of Aven in human testis are positively correlated with quality of spermatogenesis. Concerning androgen regulated gene, the expression of Regucalcin (RGN) in response to 5α-dihydrotestosterone was characterized, and RGN shown to be expressed by all cells in rat and human testis. Regucalcin is involved in the control of intracellular calcium concentration and regulation of cell proliferation and apoptosis, processes whose regulation is of pivotal importance in the control of spermatogenesis. Estrogens and androgens are well recognized as germ cell survival factors and are known to regulate control mechanisms for testicular apoptosis. Therefore, we believe that both Aven and RGN are involved in mechanisms of germ cell survival, which are controlled by androgens and estrogens. In conclusion, this thesis has contributed to increase the knowledge about estrogenic and androgenic action in testis. The “new actors cast” to the drama that is the hormonal control of spermatogenesis open new storylines in the research of mammalian spermatogenesis and perheaps male fertility.

A espermatogénese é o processo biológico que resulta na formação e emissão dos gâmetas masculinos, i.e. os espermatozóides, o qual requer uma estricta regulação hormonal para que possa decorrer com sucesso. A importância dos androgénios (como a testosterona e a 5α-dihidrotestosterona) para a regulação da espermatogénese é bem reconhecida. Porém, mais recentemente, a importância dos estrogénios (como o 17β-estradiol) também tem sido demonstrada. Estes esteróides sexuais actuam através de factores de transcrição activados por ligando, os receptores de estrogénios α (ERα) e β (ERβ) e o receptor de androgénios (AR), respectivamente. A maioria das acções destas hormonas são alcançadas através da regulação de genes-alvo. Os dois receptores de estrogénios têm efeitos diferentes e por vezes opostos na regulação dos seus genes-alvo e a acção estrogénica irá depender da interacção entre eles, quando co-expressos na mesma célula. A expressão de ERα e ERβ no testículo humano tem sido objecto de forte debate, e uma resposta definitiva sobre se apenas o ERβ ou ambos os ERs são expressos seria fundamental para a compreensão das acções dos estrogénios na espermatogénese humana. Vários variantes de ERα e ERβ gerados por processamento alternativo de RNA mensageiro foram descritos no testículo, desempenhando papéis importantes na regulação dos respectivos receptores protótipo. Em contraste, apenas um variante do AR foi descrito até agora no testículo humano, apesar de se esperar a existência de mais variantes responsáveis por acções reguladoras ou não-clássicas. A definição do transcriptoma regulado pelos estrogénios e androgénios é também de suma importância para a compreenção dos papéis desempenhados pelas hormonas esteróides sexuais no testículo. Na presente tese, os objectivos foram clarificar a expressão do ERα e ERβ no testículo humano, procurar variantes alternativos do AR, e identificar e caracterizar novos genes regulados por estrogénios e androgénios com potencial importância no controlo da espermatogénese. Os resultados apresentados demonstram inequivocamente que tanto o ERα como o ERβ são expressos no testículo humano e clarificam a sua distribuição celular. Foi confirmada a existência de formas alternativas do AR no testículo, com a identificação de quatro novos variantes, dois deles apresentando-se conservados ao longo da linha evolutiva dos vertebrados, indicando uma importância funcional. No que se refere ao transcriptoma regulado pelos esteróides sexuais, foram identificados dois novos genes, um regulado por estrogénios e outro por androgénios. O inibidor da apoptose e modulador da resposta a danos no DNA Aven foi identificado como um novo gene-alvo para os estrogénios no testículo. Pela primeira vez a sua expressão e distribuição celular foi caracterizada no testículo humano e de rato, encontrando-se presente em células de Sertoli e células germinativas. Talvez mais importante ainda, demonstrámos que os níveis de expressão de Aven no testículo humano estão positivamente correlacionados com a qualidade da espermatogénese. Relativamente ao gene regulado por androgénios, a Regucalcina (RGN), foi caracterizada a sua expressão em resposta à 5α-di-hidrotestosterona, e demonstrou-se que se localiza em todos os tipos celulares do testículo humano e de rato. A RGN está envolvida no controlo do cálcio intracelular e na regulação da proliferação celular e apoptose, processos cuja regulação tem uma importância fulcral para o controlo da espermatogénese. Os estrogénios e androgénios são reconhecidos factores de sobrevivência das células germinativas e regulam os mecanismos de controlo da apoptose testicular. Pensamos que tanto o Aven como a RGN estarão envolvidos nos mecanismos de sobrevivência das células germinativas, que são controlados por estrogénios e androgénios. Em conclusão, esta tese contribuiu para aumentar o conhecimento acerca das acções estrogénicas e androgénicas no testículo. A identificação de “novos actores” no “elenco” do “drama” que é o controlo hormonal da espermatogénese abre novas perspectivas de abordagem na investigação da espermatogénese nos mamíferos e permite clarificar as bases moleculares da infertilidade masculina.