Γονιδιακή κλωνοποίηση μορίου κυτταρικής συνάφειας του νευρικού συστήματος

Abstract

The molecular cloning, characterization and identification of biological function of the cell adhesion molecules in the nervous system of vertebrates and invertebrates will be the guide to our understanding of the molecular mechanisms involved in the development of the nervous system (cell migration, differentiation, cell aggregation, growth and fasciculation of axons, synaptic connections). In this work, LN-10 cell adhesion molecule (chick) has been cloned with the use of heterologous cDNA probe (rat). The LN-10 molecule is expressed specifically in the chick nervous system (cerebellum, optic lobus, hemispheres) and is absent from non-neuronal tissues (liver, blood, intestine). The expression of LN-10 molecule increases gradually until post hatching day 2 and a decrease follows. LN-10 mRNA is expressed in granule cells of chick cerebellum and comparison with other molecules shows homology to Elastin precursors, chick N-Cadherin and Drosophila Notch protein. The study of the LN-10 molecule was carried out with the techniques: synthesis and screening cDNA bank, Southern, Northern and Western blot, in situ RNA-RNA hybridization and DNA sequencing. The results of the above studies are as follows: 1. Western blot analysis revealed NILE protein molecules in chick cerebellum. Their size differs to that reported for another chick CAM, namely NgCAM. 2. NILE-related P12-13 cDNA clone from PC12 cells exhibits homology with chick genomic DNA fragments, in Southern blot analysis. 3. Three cDNA clones have been detected from λgt11 cDNA library from 2-days old chick cerebellum, with the use of P12-13 cDNA clone as heterologous probe (LN-9 0.5kb, LN-11 1.8kb, LN-10 2.0kb). 4. The LN-10 clone derives most probably from a single gene, which contains at least one intron as shown by restriction enzyme analysis. 5. The largest messanger, which is detected from LN-10 probe in cerebellum is approx. 2.0kb long. 6. The LN-10 clone is absent in non-neuronal tissues while are detected in optic lobus and hemispheres more messangers (2.0, 4.2, 5.2 and 6.8kb), which possibly result from alternative splicing of a single gene transcription product. 7. The RNA detected by the LN-10 clone is present in chick cerebellum from E14 embryonic day, increases the days around hatching and is almost not expressed at post-hatching day 17. 8. The nucleotide sequence of LN-10 clone was determined (1941 nucleotides). It contains an ORF 1629 nt and probably it synthesizes a polypeptide sequence of 543 amino acids. 9. Genomic clones of LN-10 molecule were isolated from λEMBL₄ chick genomic library.

Η μοριακή κλωνοποίηση, ο χαρακτηρισμός και, η διαλεύκανση της βιολογικής λειτουργίας των μορίων κυτταρικής συνάφειας στο νευρικό σύστημα σπονδυλωτών και, μη, θα οδηγήσει, στην κατανόηση των μοριακών μηχανισμών που περιλαμβάνονται σε σημαντικά βήματα της ανάπτυξης του νευρικού συστήματος (κυτταρική μετανάστευση, διαφοροποίηση, κυτταρική συσσώρευση, ανάπτυξη και δεσμοποίηση νευραξόνων, συνάψεις). Σε αυτή την εργασία κλωνοποιήθηκε το μόριο κυτταρικής συνάφειας LN-10 στην όρνιθα με ετερόλογο cDNA ανιχνευτή (αρουραίου). Το μόριο LN-10 εκφράζεται ειδικά στο νευρικό σύστημα όρνιθας (παραγκεφαλίδα, οπτικό λοβό, ημισφαίρια) και απουσιάζει από μη νευρικούς ιστούς (συκώτι, αίμα, έντερο). Η έκφραση του μορίου LN-10 αυξάνει σταδιακά στην παραγκεφαλίδα μέχρι την 2 ημέρα μετά την γέννηση από την 14 εμβρυϊκή ημέρα και ακολούθως ελαττώνεται σημαντικά. Το μόριο LN-10 εκφράζεται σε κοκκώδη κύτταρα της εξωτερικής και εσωτερικής κοκκώδους στοιβάδας παρεγκεφαλίδας και οπτικού λοβού. Σύγκριση του LN-10 με άλλα μόρια δείχνει ομολογία με πρόδρομα μόρια Ελαστίνης, με την N-Cadherin στην όρνιθα και την Notch πρωτεΐνη στην Δροσόφιλα. Η μελέτη του μορίου LN-10 έγινε με τεχνικές: Σύνθεσης και διαλογής cDNA βιβλιοθήκης, Southern, Northern και Western blot, in situ RNA-RNA υβριδοποίησης και προσδιορισμού της νουκλεοτιδικής αλληλουχίας. Τα αποτελέσματα των παραπάνω μελετών έχουν ως εξής: 1. Με πειράματα Western blot ανιχνεύονται σε παραγκεφαλιδα όρνιθας πρωτεϊνικά μόρια με αντίσωμα anti-NILE, τα οποία διαφέρουν από τα μόρια που αναγνωρίζει αντίσωμα anti-NgCAM, στον ίδιο ιστό. 2. 0 σχετικός με την γλυκοπρωτεΐνη NILE, cDNA κλώνος Ρ12-13 από κύτταρα PC12 εμφανίζει ομολογία με κλάσματα DNA γονιδιώματος όρνιθας. 3. Ανιχνεύθηκαν τρεις cDNA κλώνοι από cDNA βιβλιοθήκη λgt11 παραγκεφαλίδας όρνιθας ηλικίας 2 ημερών με την χρήση του Ρ12-13 σαν ανιχνευτή (LN-9 0.5kb, LN-11 1.8kb, LN-10 2.0kb). 4. 0 κλώνος LN-10 προέρχεται πιθανόν από ένα γονίδιο και διακόπτεται στο επίπεδο του γονιδιώματος της όρνιθας από μία τουλάχιστον εμβόλιμη αλληλουχία. 5. Το μεγαλύτερο μήνυμα που αναγνωρίζει ο κλώνος LN-10 στον ιστό της παραγκεφαλίδας, είναι περίπου 2.0kb. 6. 0 κλώνος LN-10 απουσιάζει από μη νευρικούς ιστούς όρνιθας ενώ αναγνωρίζει στον οπτικό λοβό και στα ημισφαίρια μηνύματα RNA (2.0, 4.2, 5.2 και 6.8kb), τα οποία πιθανό να προέρχονται από διαφορική ωρίμανση του mRNA ενός γονίδιου. 0 κλώνος LN-10 εμφανίζεται στην παραγκεφαλίδα όρνιθας από την Ε14 εμβρυϊκή ημέρα, αυξάνεται η παρουσία του τις ημέρες γύρω από την γέννηση και σχεδόν εξαφανίζεται σε ώριμη όρνιθα Ρ17. 8. Προσδιορίσθηκε η νουκλεοτιδική αλληλουχία του κλώνου LN-10 (1941 νουκλεοτίδια), η οποία περιλαμβάνει ένα ανοιχτό πλαίσιο ανάγνωσης 1620 νουκλεοτιδίων και μπορεί να συνθέτει πολυπεπτιδ ική αλυσίδα 543 αμινοξέων. Σύγκριση με γνωστά μόρια και ιδιαίτερα με μόρια CAM έδειξε ομολογία με πρόδρομα μόρια Ελαστίνης με την N-Cadherin στην όρνιθα και Notch στην Δροσόφιλα. Απομονώθηκαν γονιδιακοί κλώνοι σχετικοί με τον LN-10 από βιβλιοθήκη γονιδιώματος όρνιθας λΕΜΒL.