Καθαρισμός, ιδιότητες και εξειδίκευση ισομορφών κινασών των διφωσφονουκλεοζιτών από ενδοσπέρμιο καλαμποκιού - μοριακές προσεγγίσεις

Abstract

During the development of maize endosperm two peptide chains of 18 and 16.5 kDa undergo aytophosphorylation. These peptides were recognized to be the catalytic sybunits of nucleoside diphosphate kinases and were named NDPK-A and NDPK-B respectively. The course of purification and seperation used for NDPK-A and NDPK-B included the following steps: 1) initial extract, 2) hypercentrifugation supernatant 3) 50-75% fraction of ammomniun sulfate saturation 4) DEAE Sephadex chromatography 5) hydroxyapatite chromatography 6) Sephadex G150 chromatography 7a) electroelution of NDPK-A and 7b) electroelution of NDPK-B. The final purification achieved was 26758 and 29731 fold respectively. The two steps of the reaction catalyzed by NDP kinases were studied seperataly. The study of the autophosphorylation reaction revealed that NDPK-A and NDPK-B are a) thermostable enzymes (retaining 70% of their reactivity at 80o C) b) their autophosphorylation reactivity remains almost unchanged in the presence of metal cations, EDTA, NaCl (200 mM), and urea (5M), and is uniformly changed at different pH values in the presence of Mg2+, Ca2+ or EDTA., c) the autophosphorylation reactivity is reduced by 85% in the presence of 10 mM 1-P-glucose, and lost in the presence of UDP-galactose but not in the presence of galactose d) the holoenzymes have the same molecular mass (17.000) and thir molecules are both consisted of six catalytic subunits (each of which has the ability to be autophsposphorylated and to form mono-, di-, tri-, tetra-, penta-, and hexa- mers) e) the residue undergoing autophosphorylation is a histidine f) they are both recognized by the antibodies raised for each of them and present the same substrate specificity towards the diphosphonucleosides (the order of preference is UDP>ADP>dGDP>GDP>dCDP). The two NDP kinases differ in respect to their molecular weights and their isoelectic points (NDPK-A: M.W.=18.000 pI=5.95 and NDPK-B: M.W.=16.500, pI=6.4). As far as the phosphorylating activity of NDPK-A and NDPK-B is concerned: a) the presence of metal cations is necessary (except for Ni2+ which inhibits the reaction) b) they have two optimum pH values (7 and 9) c) the presence of DNA or RNA does not influence their activity d) the presence of sugar compounds does not significantly change their activity (cellulose, maltose, cellobiose, UDP-galactose, PP-ribose). Two more NDP kinases (NDPK-Γ and NDPK-Δ ) from the roots of A. murale, were seperated by DEAE-Sephadex chromatography. NDPK-Δ (16kDa) can survive after stress induced by the presence of 0.5 mM Ni2+ and retains by 50% the phosphorylating activity in the presence if Ni2+ (1 mM), in contrast to the NDP kinases fron maize endosperm. NDPK- also exhibits a strong preference towards ADP (Km=5.5nm). At the molecular level an attempt was made to isolate the genes encoding NDP kinases in maize. Primers were designed based on the conserved sequences of the rice NDP kinase genes and with the use of polymerase chain reaction two cDNA segments of the NDP kinase genes were isolated (340 basepairs each). The sequences of these two segments corespond to the sequence of NDPKI and NDPKII from spinach respectively. Further studies are required to determine the gene origin of NDPK-A and NDPK-B

Κατά την ανάπτυξη του ενδοσπερμίου καλαμποκιού υφίστανται αυτοφωσφορυλίωση δύο πεπτιδικές αλυσίδες των 18 και 16.5 kDa που ταυτοποιήθηκαν ως καταλυτικές υπομονάδες των κινασών των διφωσφονουκλεοζιτών και ονομάστηκαν NDPK-A και NDPK-B αντίστοιχα. Η πορεία καθαρισμού και διαχωρισμού των NDPK-A και NDPK-B που ακολουθήθηκε περιέλαβε τα ακόλουθα στάδια: 1) αρχικό εκχύλισμα 2) υπερκείμενο υπερφυγοκέντρησης 3) κλάσμα 50-75% κορεσμού σε θειικό αμμώνιο 4) χρωματογραφία σε DEAE Sephadex 5) χρωματογραφία σε υδρόξυαπατίτη 6) χρωματογραφία σε Sephadex G-150 7α) ηλεκτροέκλουση της NDPK-A 7β) ηλεκτροέκλουση της NDPK-B. Ο καθαρισμός που επιτεύχθηκε ήταν 26785 και 29731 φορές αντίστοιχα. Τα δύο στάδια της αντίδρασης που καταλύουν οι NDP κινάσες μελετήθηκαν ξεχωριστά. Από την μελέτη της δραστικότητας αυτοφωσφορυλίωσης προέκυψε ότι η NDPK-A και η NDPK-Β α) είναι θερμοάντοχα ένζυμα (διατηρούν 70% της δραστικότητας τους στους 80ο C), β) η δραστικότητα αυτοφωσφορυλίωσης παρέμεινε σχεδόν ανεπηρέαστη παρουσία κατιόντων δισθενών μετάλλων, EDTA, NaCl (200 mM) και ουρίας (5Μ), και μεταβάλλεται ομοιόμορφα σε διάφορες τιμές pH παρουσία Ca2+, Mg2+ ή EDTA, γ) η δραστικότητα αυτοφωσφορυλίωσης μειώνεται κατά 85% παρουσία 10 mM 1-Ρ-γλυκόζης και φωσφορυλιώνουν της UDP-γαλακτόζη αλλά όχι τη γαλακτόζη, δ) έχουν το αυτό μοριακό βάρος (Μ.Β.=107000) και το μόριο τους συνίσταται από έξι καταλυτικές υπομονάδες που η κάθε μια αυτοφωσφορυλιώνεται και που έχουν τη δυνατότητα σχηματισμού μονο-, δι- τρι-, τετρα-, πεντα- και εξα- μερών, ε) φωσφορυλιώνονται σε υπόλειμμα ιστιδίνης, στ) δίνουν τις ίδιες ανοσοαντιδράσεις με τα αντισώματα που έγιναν έναντι τους και παρουσιάζουν την ίδια εξειδίκευση ως προς τους διφωσφονουκλεοζίτες (με σειρά προτίμησης: UDP>ADP>dGDP>GDP>dCDP). Οι μόνες διαφορές που παρουσιάζουν είναι στα Μ.Β. των καταλυτικών τους υπομονάδων και στα ισοηλεκτρικά τους σημεία (NDPK-A: M.B.=18.000, pI= 5.95 και NDPK-B: M.B.=16.500, pI= 6.4) Σε ότι αφορά την φωσφορυλιωτική δραστικότητα των NDPK-A και NDPK-Β διαπιστώθηκε ότι: α) η παρουσία δισθενών κατιόντων μετάλλων είναι απαραίτητη (εκτός του Ni2+που την παρεμποδίζει), β) παρουσιάζουν δύο βέλτιστες τιμές pH (7 και 9), γ) δεν επηρεάζεται παρουσία DNA ή RNA και δ) δεν μεταβάλλεται ουσιαστικά παρουσία ενώσεων σακχάρων (κυτταρίνη, 1Ρ-γλυκόζη, μαλτόζη, κελλοβιόζη, UDP- γαλακτόζη, ΡΡ-ριβόζη). Επιπρόσθετα δύο NDP κινάσες (NDPK-Γ και NDPK-Δ) από την ρίζα του A.murale (φυτό που συσσωρεύει Ni2+) διαχωρίστηκαν σε στήλη DEAE Sephadex. Η NDPK-Δ (16 kDa) επιβιώνει μετά από καταπόνηση (stress) τού φυτού σε 0.5 mM Ni2+και διατηρεί την φωσφορυλιωτική της δραστικότητα κατά 50% παρουσία Ni2+ (1mM), σε αντίθεση με τις NDP κινάσες του ενδοσπερμίου καλαμποκιού. Η NDPK-Δ παρουσιάζει ιδιαίτερη προτίμηση ως προς το ADP (Κm= 5.5nm). Σε μοριακό επίπεδο έγινε μία προσπάθεια απομόνωσης των γονιδίων που κωδικοποιούν τις NDP κινάσες από καλαμπόκι. Σχεδιάστηκαν εκκινητές βάση των συντηρημένων αλληλουχιών των γονιδίων NDP κινασών από ρύζι και με την χρήση της αλυσιδωτής αντίδρασης της πολυμεράσης απομονώθηκαν δύο τμήματα των γονιδίων των NDP κινασών από cDNA, περίπου 340 βάσεις το καθένα. Οι αλληλουχίες τους αντιστοιχούν σε αλληλουχίες των NDPK I και NDPK II αντίστοιχα από φύλλα σπανακιού. Περεταίρω μελέτες απαιτούνται για τον καθορισμό της γονιδιακής προέλευσης των NDPK-A και NDPK-B.