Μελέτη της δομής των συμπλεγμάτων λιπιδικών μεμβρανών με L-αργινίνη, βινβλαστίνη και pDNA. Μοριακή οργάνωση - μεταπτώσεις φάσης των λιπιδικών διπλοστιβάδων

Abstract

The main topic of the dissertation is the study of the interactions of synthetic lipid membranes with biomolecules of biological or medical interest. These membranes often mimic the behaviour of real cell membranes of living organisms. The study focussed primarily on the exploration of the mechanisms guiding these interactions and more specifically of the role of the molecular order within the membrane, of the size and the geometrical characteristics and finally of the charge of the interacting biomolecules. The experimental studies included the interaction of spherical liposomal particles in solution with the relatively bulky and geometrically incompatible with the lipids, chemotherapeutic molecule of vinblastine, as well as with the aminoacid L-arginine and finally the more complex interaction of cationic liposomes with plasmid DNA. For the experiments the following techniques have been employed: Dynamic light scattering and zeta potential measurements for determining the size and the surface charge distribution of the liposomes and their complexes with the respective biomolecules. High-precision differential scanning calorimetry for the exploration of phase diagrams and the study of phase transitions of lipid membranes and their complexes. Isothermal titration calorimetry for the thermodynamic study of the interactions in real time. Circular dichroism for the study of structural and conformational changes of the lipid membranes and DNA during their interaction. From the comparative calorimetric studies between DPPC and DMPC unilamellar liposomal suspensions and analogous systems with encapsulated vinblastine, it was demonstrated that vinblastine induces a thermodynamically stable interdigitated phase of the lipid bilayers with partial overlap of the aliphatic chains. The effect was weaker in the case of the shorter DMPC lipids. When cholesterol is also present in the bilayer, it competes with vinblastine for the space near the lipid polar heads thus destroying the chain interdigitization. The interaction of L-arginine with unilamellar DHP-Na liposomes revealed the dual role of L-arginine depending on the molecular order of the bilayer membrane. It was shown that L-arginine enhances the crystallinity of the organised lipid phases while at high-temperatures the aminoacid penetrates the bilayer inducing disorder and fluidity of the membrane.

Αντικείμενο της παρούσας διατριβής είναι η μελέτη αλληλεπιδράσεων τεχνητών λιπιδικών μεμβρανών, οι οποίες προσομοιάζουν πραγματικές κυτταρικές μεμβράνες ζώντων οργανισμών, με βιομόρια μεγάλου βιολογικού, φαρμακευτικού και ιατρικού ενδιαφέροντος. Οι μελέτες εστιάζονται στη διερεύνηση των αλληλεπιδράσεων αυτών και κυρίως του ρόλου της μοριακής τάξης των λιπιδικών μορίων της μεμβράνης, του μεγέθους, των γεωμετρικών χαρακτηριστικών και του φορτίου των αλληλεπιδρώντων βιομορίων. Συγκεκριμένα μελετήθηκαν οι αλληλεπιδράσεις σφαιρικών λιπιδικών κυστιδίων, των λιποσωμάτων, με το σχετικά ογκώδες και γεωμετρικά ασύμβατο με τα λιπίδια, χημειοθεραπευτικό μόριο της βινβλαστίνης, με το αμινοξύ L-αργινίνη, καθώς και οι πλέον πολύπλοκες αλληλεπιδράσεις κατιονικών λιποσωμάτων με πλασμίδιο DNA. Για τις πειραματικές μελέτες χρησιμοποιήθηκαν οι τεχνικές δυναμικής σκέδασης φωτός, και μέτρησης δυναμικού ζ για τον προσδιορισμό του μεγέθους και της επιφανειακής κατανομής φορτίου των λιποσωμάτων και των συμπλόκων. Η θερμιδομετρία διαφορικής σάρωσης μεγάλης ακρίβειας χρησιμοποιήθηκε για τη διερεύνηση διαγραμμάτων φάσης καθώς και για τη μελέτη των μεταπτώσεων φάσης των λιπιδικών μεμβρανών και των συμπλόκων τους με τα υπό μελέτη βιομόρια. Η θερμιδομετρία ισόθερμης τιτλοδότησης χρησιμοποιήθηκε για τη θερμοδυναμική μελέτη των αλληλεπιδράσεων σε πραγματικό χρόνο, ενώ ο κυκλικός διχροϊσμός για τον χαρακτηρισμό των πιθανών δομικών μεταβολών του DNA κατά την αλληλεπίδρασή του με τις κατιονικές μεμβράνες. Tα αποτελέσματα συγκριτικών μελετών για την αλληλεπίδραση λιποσωμάτων DPPC και DMPC, παρουσία και απουσία χοληστερόλης, με βινβλαστίνη κατέδειξαν ότι η βινβλαστίνη επάγει τάξη μερικής επικάλυψης των αλειφατικών αλυσίδων των λιπιδικών μορίων. Το φαινόμενο είναι ασθενέστερο για τα λιποσώματα που διαθέτουν αλειφατικές αλυσίδες μικρότερου μήκους. Καταδείχτηκε επίσης η συνδυασμένη δράση βινβλαστίνης και χοληστερόλης στη μοριακή τάξη της λιπιδικής μεμβράνης όπου ο χωρικός τους ανταγωνισμός επάγει τελικώς αταξία στη μεμβράνη. Η αλληλεπίδραση λιποσωμάτων του τεχνητού λιπιδίου DHP-Na με το αμινοξύ L-αργινίνη ανέδείξαν τον πολύ διαφορετικό ρόλο της L-αργινίνης στην αλληλεπίδραση ανάλογα με τη φάση της λιπιδικής μεμβράνης.