Συμβολή στη μελέτη της ανοσολογικής απάντησης ενήλικων και ανήλικων προβάτων και αιγών με κλασικές και νεότερες ορολογικές δοκιμές μετά από οφθαλμικό εμβολιασμό με εμβόλιο REV-1

Abstract

The aim of this study was to assess the serological response of young and adult sheep and goats, following Rev-1 vaccination conjunctively, by the application of classical tests such as Rose Bengal (RB) and Complement Fixation (CF) along with new tests such as modified RB (m-RB), indirect ELISA (i-ELISA), competitive ΕLISA (c-ELISA) and Fluorescence Polarization Assay (FPA). The purpose of the present work was to study the course of the vaccinal antibodies, in order to define which of these tests is the most appropriate and up to what time is valid for controlling vaccinated small ruminants. Both parameters are particularly important for a brucellosis control-eradication program. Additionally, the classical as well as the new serological tests were evaluated. One sheep and one goat flock located in the Larissa prefecture were selected. These flocks were officially brucellosis-free, according to the rules imposed by O.I.E. The selected experimental animals were 106 sheep, 49 lambs, 69 goats and 64 kids. Additionally 94 animals (30 sheep, 15 lambs, 10 rams, 19 goats, 10 kids and 10 dams) were included as controls. Prior to vaccination, sera from all selected animals were tested with RB and CF and proved to be negative for Brucella spp antibodies. On day 0, all selected animals, except of the controls were conjunctively vaccinated with B. melitensis strain Rev-1 vaccine, at the standard dose (1,6X109cfu). In control animals a drop of normal saline was administered in the conjunctiva. Blood samplings were performed at pre-selected post-vaccination intervals, from sheep and lambs on days 21, 42, 63, 91, 125, 159, 223, 330 and from goats and kids on days 22, 44, 65, 95, 125, 155, 230, 335. The same serial blood sampling protocol, respective to species, was applied to the controls. Sera were tested by: RB, m-RB, CF, i-ELISA, c-ELISA and FPA assays. The criteria of positivity (cut off) set for each assay, were for RB and m-RB the agglutination traces, for CF the title ? 20 ICFU/ml, for i-ELISA the OD levels >100% of the OD level of the positive control serum, for c-ELISA levels PI>30% in relation to the buffer control (0% PI), and for FPA levels the>87 mP. The control animals remained negative to all serological assays throughout the experimental period. Antibodies were detected from all experimental animals 3 weeks post-vaccination, by at least one serological test. This proves that the vaccination was performed properly. At the same time, the highest percentages of seropositive animals were recorded by all assays used, except i-ELISA. Concerning the latter assay, the highest percentage of positive animals was recorded 6 weeks later in sheep and 3 weeks later in goats, lambs and kids. Antibodies were detected in sheep up to 11 months post-vaccination by all tests. However, when sera were tested by CF, c-ELISA and FPA in the 11th month, the number of seropositive animals was not significantly different (P>0.05), compared to the pre-vaccination one. Additionally, at the same period, the above mentioned assays gave similar results. On the contrary, high numbers of seropositive animals were detected, even after 11 months post-vaccination, by RB, m-RB and i-ELISA. These results strongly indicate that the control of the seropositivity of vaccinated sheep can be safely performed by CF, c-ELISA or FPA, at least one year post-vaccination.

Η παρούσα έρευνα είχε ως στόχο να συμβάλει στη μελέτη της ανοσολογικής απάντησης ενήλικων και ανήλικων προβάτων και αιγών μετά από οφθαλμικό εμβολιασμό με κανονική δόση εμβολίου Rev-1. Εφαρμόστηκαν οι εγκεκριμένες δοκιμές του ερυθρού της Bεγγάλης (Rose Bengal, RB) και σύνδεση του συμπληρώματος (CF), καθώς και οι νεότερες, όπως η τροποποιημένη Rose Bengal (m-RB), η έμμεση ανοσοενζυμική δοκιμή (i-ELISA), η ανταγωνιστική ανοσοενζυμική δοκιμή ( c-ELISA) και η δοκιμή πόλωσης του φθορίζοντος φωτισμού (FPA). Σκοπός της έρευνας ήταν ο έλεγχος της πορείας των εμβολιακών αντισωμάτων μετά τον εμβολιασμό, προκειμένου να καθοριστεί ο ακριβής χρόνος ελέγχου των εμβολιασμένων ζώων, που είναι ιδιαίτερα σημαντικός στην εφαρμογή προγράμματος ελέγχου της βρουκέλλωσης. Παράλληλα αξιολογήθηκαν οι νεότερες δοκιμές προκειμένου να διαπιστωθεί αν θα μπορούσαν να αποδειχθούν χρήσιμες για την ασφαλή διάκριση εμβολιασμένων ζώων από τα μολυσμένα με φυσικά στελέχη των ειδών του γένους Brucella. Επιλέχθηκαν δύο εκτροφές του νομού Λαρίσης, μία προβάτων, από την οποία επιλέγησαν 106 πρόβατα και 49 αμνοί και μία αιγών, από την οποία επιλέγησαν 69 η αίγες και 64 ερίφια. Οι εκτροφές είχαν χαρακτηρισθεί ως «επίσημα απαλλαγμένες» βρουκέλλωσης, διότι τηρούσαν όλους τους κανόνες που τίθενται από το Διεθνές Γραφείο Επιζωοτιών (Ο.Ι.Ε.). Επιπλέον, 94 ζώα (30 πρόβατα, 15 αμνοί, 10 κριοί, 19 αίγες, 10 ερίφια, 10 τράγοι) επιλέχθηκαν για να χρησιμοποιηθούν ως μάρτυρες. Πριν από τον εμβολιασμό, όλα τα επιλεγμένα ζώα ελέγχθηκαν με τις δοκιμές RB και CF και ήταν αρνητικά ως προς τη βρουκέλλωση. Την ημέρα μηδέν σε όλα τα επιλεγμένα ζώα, εκτός από τους μάρτυρες, χορηγήθηκε κανονική δόση (1,6X10cfu) εμβολίου Rev-1 δια της οφθαλμικής οδού. Στα ζώα μάρτυρες αντί για εμβόλιο, χορηγήθηκε μία σταγόνα φυσιολογικού ορού στον επιπεφυκότα. 9 Aπό τα εμβολιασμένα ζώα πραγματοποιήθηκαν αιμοληψίες σε προκαθορισμένα χρονικά διαστήματα μετά τον εμβολιασμό, δηλαδή την 21η, 42η, 63η, 91η, 125η, 159η, 223η, 330η ημέρα για τα πρόβατα και τους αμνούς και την 22η, 44η, 65η, 95η, 125η, 155η, 230η, 335η για τις αίγες και τα ερίφια. Παράλληλα πραγματοποιήθηκαν αιμοληψίες και από τα ζώα μάρτυρες. Τα δείγματα ορών ελέγχθηκαν με τις δοκιμές RB, m-RB, CF, i-ELISA, c-ELISA και FPA. Ως κριτήρια θετικότητας ορίστηκαν για τις RB και m-RB τα ίχνη συγκόλλησης, για την CF τίτλος ? 20 ICFU/ml, για την i-ELISA τιμή OD>100% της τιμής OD του μάρτυρα θετικού ορού, για την c-ELISA τιμή PI>30% σε σχέση με τον μάρτυρα του ρυθμιστικού διαλύματος (0% PI) και για την FPA τιμή >87 mP. Όλα τα ζώα μάρτυρες έδωσαν αρνητικό αποτέλεσμα σε όλες τις ορολογικές δοκιμές, σε όλη τη διάρκεια του πειραματισμού. Το σύνολο των εμβολιασμένων ζώων έδωσε θετικό αποτέλεσμα 3 εβδομάδες μετά τον εμβολιασμό, σε περισσότερες από μία ορολογικές δοκιμές, γεγονός που επιβεβαιώνει ότι ο εμβολιασμός εκτελέστηκε σωστά. Το ίδιο χρονικό διάστημα διαπιστώθηκαν τα μεγαλύτερα ποσοστά οροθετικών ζώων, σε όλες τις δοκιμές εκτός από την i-ELISA. Στη συγκεκριμένη δοκιμή, το μεγαλύτερο ποσοστό οροθετικών παρατηρήθηκε καθυστερημένα, σε σχέση με τις υπόλοιπες, κατά 6 εβδομάδες για τα πρόβατα και κατά 3 εβδομάδες για τους αμνούς, αίγες και ερίφια.