Η επίδραση του καδμίου στην ανάπτυξη της escherichia coli και του proteus mirabilis

Abstract

In the presented work the effects of Cd in various doses in bacteria Escherichia coli and Proteus mirabilis and also in combination with the antibiotic cefuroxime were studied. First of all, 0.16 pg/l ofCd caused a beneficial effect on Escherichia coli, and on Proteus mirabilis, increasing the growth rate especially after 6 hours of incubation and also the colony formation. Furthermore, the concentrations of 0.25, 0.5, 1.0 and 1.5 pg/l of Cd were toxic on Escherichia coli, and on Proteus mirabilis causing a decrease in cell growth from 0 to 24 hours. The dose of 1.5 pg/l of Cd caused the highest toxicity of all studies concentrations 0.25, 0.5 καν 1.0 pg/l of Cd against Escherichia coli, and Proteus mirabilis by decreasing the growth rate and the colony formation of both bacteria. Moreover the results showed that the growth rate of Escherichia coli was higher than that of Proteus mirabilis in all Cd doses and in all incubation time periods. Therefore Escherichia coli is more resistant against the toxicity caused by Cd than Proteus mirabilis. Moreover it was found that both Escherichia coli and Proteus mirabilis are sensitive to the antibiotic cefuroxime. In the absence of cefuroxime there was an increase in growth rate of both bacteria and in both Cd concentrations (0.16 pg/l και 1.50 pg/l); the growth rate of Escherichia coli was higher than that of Proteus mirabilis. Furthermore there were significant differences between the growth rates of the two Cd doses (0.16 pg/l και 1.50 pg/l) in both bacteria especially after the 6th hour of incubation, when cefuroxime was absent. There were also differences in colony formation of the two Cd doses (0.16 pg/l και 1.50 pg/l) in both bacteria. The presence of cefuroxime resulted in the loss of differences in growth rates between Escherichia coli and Proteus mirabilis and also between the two Cd concentrations (0.16 pg/l και 1.50 pg/l), caused during the incubation time. It was also resulted in the complete inhibition of colony formation of both bacteria in both Cd concentrations and in all incubation times. Cadmium (Cd) is a rare metal being 67th in order of chemical abundance it is found in the Earth's crust at an average concentration of 0.1 mg/kg. Cd is also bioaccumulative, very toxic to humans and it is persistent in the environment (t1/2 of 10-30 years) and in the human organism (t1/2 more than 15 years. During the 20th century, the burden of Cd in the human body of the general population of the industrially developed countries has been raised as a result of the uncontrolled industrial emission in the past. Furthermore, Cd can cause damage in the kidneys after prolonged exposure under industrialised conditions or under contaminated environment. Biological markers of nephrotoxicity caused by Cd, are β₂-microglobin, RBP, α₁-microglobin, CC16 and NAG. Urinary tract infections are caused by the entrance and the installation of microorganisms in the urinary tract, are usually frequent and are distinguished in bacteria or fungal infections. Escherichia coli, and especially bacteria that are in gastrointestinal tract, is the bacterium that causes urinary infections more frequently (90% of non-hospitalized and 50% of hospitalized infection), that are more common in women especially after the menopause, than in men and they also affect elderly people. Concerning the therapy against urinary infection several chemotherapeutics and antibiotics are used such as sulphonamides, ampicillin, tetracycline, aminoglucosides, chloramphenicol, cephalosporins. Proteus mirabilis also causes urinary infections (10% after Escherichia coli, Klebsiella spp), it affects young males and rarely young females, elderly people, patients with abnormalities in urinary tract, hospitalized patients with urine collector and with obstruction. The ability of the bacterium to cause urinary infections is due to the production of NH₄OH by urea and also due to its adhesion on the urinary tract. Concerning the therapy it is known that P. mirabilis is sensitive in ampicillin and in cephalosporins. According to various articles of studies that took place in the past, many toxic heavy metals, including Cd, have been found in urine samples of humans living in various areas in which they are exposed in these metals (industrial areas, coal mining areas, in car, metal and food industries, arias of diesel fumes and environments of home waste incinerators). Cd is known to cause toxic effect on Escherichia coli by various mechanisms such as the induction of activity specific stress proteins, the production of endocytotic super oxide, DNA damage, the anaerobic metabolism, the accumulation of r-proteins, and the transposition of Cd to the proteins that are Zn-linked and are rich in cysteine and oxidizing stress caused by the interference of Cd in the respiration of the bacterium. There were no such studies for Proteus mirabilis. Finally it was found that there are bacterial plasmids in Escherichia coli that carry genes which provide very specific resistance against various metals including Cd. These are the ATPase cadA that free the cells from Cd, the genes pcoABCD and pcoRS that provides resistance to Cd, Zn, and Pb, the metal ion efflux protein Czr and Czc that when is expressed on E. coli provides high resistance against Zn and Cd ions and the human protein MDR1 and the bacterial MDR proteins LmrA and OmrA that provide resistance to Escherichia coli against the toxicity of Cd. The results of the presented work indicated that Cd in urine can significantly affect the growth rate of Escherichia coli and Proteus mirabilis, the two most frequent micro organisms of urinary tract infections. This effect is differentially dependent by the metal concentrations in urine. Low doses of Cd accelerate significantly the growth rate of both micro organisms, whereas the doses that represent the mean values in normal patients and higher that these, inhibit significantly the growth rate of micro organisms and also influence the sensitivity of the microbes on cephalosporins.

Στη παρούσα μελέτη ερευνήθηκαν οι επιδράσεις διαφόρων συγκεντρώσεων Cd στα βακτήρια Escherichia coli, Proteus mirabilis και σε συνδυασμό με το αντιβιοτικό cefuroxime. Καταρχήν και στην Esherichia coli και στον Proteus mirabilis, το Cd σε συγκέντρωση 0,16 pg/l ασκεί ευεργετική δράση αυξάνοντας την ταχύτητα ανάπτυξής τους και τον σχηματισμό αποικιών. Επίσης το Cd στη συγκέντρωση 1,5 μμ/1 ασκεί τη πιο μεγάλη τοξική δράση από όλες τις άλλες συγκεντρώσεις που μελετήθηκαν (0,25, 0,5 και 1,0 μg/l Cd) στα βακτήρια Escherichia coli και Proteus mirabilis ελαττώνοντας την ταχύτητα ανάπτυξής τους από τις 0 έως και 24 ώρες επώασης καθώς και τον σχηματισμό αποικιών. Επίσης η ταχύτητα ανάπτυξης της Escherichia coli ήταν υψηλότερη από αυτή του Proteus mirabilis για όλες τις συγκεντρώσεις Cd και σε όλες τις χρονικές στιγμές επώασης και επομένως βγήκε το συμπέρασμα ότι η Escherichia coli είναι πιο ανθεκτικό βακτήριο στην τοξική επίδραση του Cd από ότι ο Proteus mirabilis. Η Escherichia coli και ο Proteus mirabilis είναι ευαίσθητα στο αντιβιοτικό cefuroxime. Η απουσία του cefuroxime προκάλεσε την αύξηση της ταχύτητας ανάπτυξης και των δύο βακτηρίων και στις δύο συγκεντρώσεις Cd (0,16 pg/l και 1,50 pg/l) με την ταχύτητα ανάπτυξης της Escherichia coli να είναι σημαντικά υψηλότερη από αυτή του Proteus mirabilis. Επίσης παρατηρήθηκαν σημαντικές διαφορές στην ταχύτητα ανάπτυξης μεταξύ των δύο συγκεντρώσεων Cd (0,16 pg/l και 1,50 pg/l) και για τα δύο βακτήρια κυρίως από τις 6 ώρες επώασης και μετά, όταν δεν υπήρχε cefuroxime. Η παρουσία του cefuroxime είχε σαν συνέπεια την εξάλειψη της διαφοράς στην ταχύτητα ανάπτυξης μεταξύ των βακτηρίων Escherichia coli και Proteus mirabilis και μεταξύ των δύο συγκεντρώσεων Cd (0,16 pg/l και 1,50 μμ/Ι) που οφείλονται στην πάροδο του χρόνου επώασης. Επίσης οδηγεί στην πλήρη αναστολή της ανάπτυξης αποικιών των δύο βακτηρίων και στις δύο συγκεντρώσεις Cd και σε όλες τις χρονικές στιγμές επώασης. Το κάδμιο (Cd) είναι ένα σπάνιο μέταλλο, κατέχει την 67η θέση σε χημική αφθονία και βρίσκεται στον φλοιό της Γης σε συγκέντρωση, κατά μέσο όρο 0,1 mg/kg. Το Cd επίσης είναι βιοσυσσωρευτικό, πολύ τοξικό στον άνθρωπο και μένει σταθερό στο περιβάλλον με χρόνο ημιζωής (t1/2 ) 10-30 χρόνια. Στον άνθρωπο, ο χρόνος ημιζωής ( t1/2 ), είναι περισσότερος από 15 χρόνια. Κατά τη διάρκεια του 20ου αιώνα, το φορτίο του σώματος σε Cd του γενικού πληθυσμού των πιο προηγμένων βιομηχανικά χωρών έχει αυξηθεί σαν αποτέλεσμα των ανεξέλεγκτων βιομηχανικών εκπομπών στο παρελθόν. Επιπλέον, το Cd μπορεί να προκαλέσει βλάβη στους νεφρούς, μετά από παρατεταμένη έκθεση σε συνθήκες βιομηχανίας ή στο μολυσμένο περιβάλλον. Βιολογικοί δείκτες της νεφροτοξικότητας από το Cd στο άνθρωπο είναι η β₂-μικροσφαιρίνη, η RBP, η α₁-μικροσφαιρίνη, η CC16 και η NAG. Λοιμώξεις του ουροποιητικού, παρατηρούνται με την είσοδο και εγκατάσταση μικροβίων στο ουροποιητικό, είναι αρκετά συχνές και διακρίνονται σε βακτηριακές ή μυκητιακές λοιμώξεις. Το βακτήριο Escherichia coli και ειδικά τα στελέχη που βρίσκονται στον γαστρεντερικό σωλήνα, είναι το συχνότερο αίτιο ουρολοιμώξεων προκαλώντας το 90% των εξωνοσοκομειακών και το 50% των νοσοκομειακών. Είναι συχνότερες στις γυναίκες (κυρίως μετά την εμμηνόπαυση) παρά στους άνδρες και για τη θεραπεία τους χρησιμοποιούνται διάφορα χημειοθεραπευτικά και αντιβιοτικά όπως σουλφοναμίδες, αμπικιλλίνη, τετρακυκλίνες, αμινογλυκοσίδες, χλωραμφενικόλη και κεφαλοσπορίνες. Το βακτήριο Proteus mirabilis αποτελεί επίσης συχνό αίτιο ουρολοιμώξεων, προσβάλει νεαρά αρσενικά και σπανιότερα θηλυκά άτομα, ηλικιωμένους, ασθενείς με δομικές ανωμαλίες στην ουροφόρο οδό, νοσηλευόμενους, καθετηριασμένους, ασθενείς που υποβάλλονται σε ιατρικούς χειρισμούς στο ουροποιητικό. Η ικανότητά του να προκαλεί ουρολοιμώξεις οφείλεται, στην παραγωγή ΝΗ₄ΟΗ από την διάσπαση της ουρίας και στα ινίδιά του, τα οποία συμβάλλουν στην προσκολλητικότητα του μικροβίου στο βλεννογόνο του ουροποιητικού συστήματος. Όσον αφορά τη θεραπεία σχεδόν όλα τα στελέχη Proteus mirabilis είναι ευαίσθητα στην αμπικιλλίνη και στις κεφαλοσπορίνες. Σύμφωνα με διάφορες έρευνες που έχουν πραγματοποιηθεί κατά το παρελθόν πολλά τοξικά μέταλλα μεταξύ των οποίων και το Cd έχουν ανιχνευτεί στα ούρα ανθρώπων που κατοικούν σε περιοχές εκτεθημένες στα μέταλλα αυτά (περιοχές εξόρυξης άνθρακα, σε βιομηχανίες αυτοκινήτων, μετάλλων και τροφίμων σε περιοχές έκθεσης σε καυσαέρια από ντίζελ). Το Cd, έχει βρεθεί ότι ασκεί τοξική δράση στο βακτήριο Escherichia coli με διάφορους μηχανισμούς όπως η αύξηση παραγωγής ορισμένων πρωτεϊνών του στρες, η ενδοκυττάρια παραγωγή υπεροξειδίου, η πρόκληση βλάβης στο DNA, η μεταβολή στον αναερόβιο μεταβολισμό, η μετατόπιση του Cd σε πρωτεΐνες που συνδέονται με τον Zn πλούσιες σε κυστεΐνη και η επαγωγή οξειδωτικού στρες από παρεμβολή του Cd, στην αλυσίδα αναπνοής του βακτηρίου. Παρόμοιες μελέτες για τον Proteus mirabilis δεν έχουν πραγματοποιηθεί. Τέλος έχει βρεθεί ότι στην Escherichia coli υπάρχουν πλασμίδια βακτηρίων με γονίδια τα οποία παρέχουν πολύ συγκεκριμένη ανθεκτικότητα σε διάφορα μέταλλα και στο Cd. Αυτά είναι η ΑΤΡαση, cadA που απαλλάσσει τα κύτταρα από το Cd, το γονίδιο pcoABCD και το pcoRS που παρέχει ανθεκτικότητα στον Cu, η τύπου-Ρ ΑΤΡαση, ZntA η οποία εξασφαλίζει ανθεκτικότητα στο Cd, στον Zn και στον Pb, η πρωτεΐνη εκροής ιόντων μετάλλων, Czr και Czc η οποία όταν εκφράζεται στην Escherichia coli έχει σαν αποτέλεσμα την αυξημένη ανθεκτικότητα στα ιόντα Zn και Cd και σε μικρότερο βαθμό στο Co και η ανθρώπινη πρωτεΐνη MDR1 όσο και οι βακτηριακές MDR πρωτεΐνες LmrA και OmrA όπου παρέχουν ανθεκτικότητα στην Escherichia coli από την τοξική επίδραση του Cd. Από την έρευνα αυτή προκύπτει ότι το Cd των ούρων μπορεί να επηρεάσει σημαντικά τον ρυθμό ανάπτυξης των δύο συχνότερων μικροβίων των ουρολοιμώξεων της Escherichia coli και του Proteus mirabilis. Η επίδραση αυτή είναι διαφορετικά εξαρτώμενη από τις συγκεντρώσεις του μετάλλου στα ούρα. Οι μικρές συγκεντρώσεις επιταχύνουν σημαντικά την ανάπτυξη και των δύο μικροβίων, ενώ συγκεντρώσεις Cd που αντιπροσωπεύουν τις μέσες απαντώμενες τιμές στα φυσιολογικά άτομα και μεγαλύτερες, αναστέλλουν σημαντικά την ανάπτυξη των μικροβίων και επηρεάζουν τις δοκιμασίες ευαισθησίας των μικροβίων στις κεφαλοσπορίνες.