Η μελέτη του γονιδίου JAK2 στα μυελοϋπερπλαστικά και άλλα σύνδρομα όσον αφορά το φορτίο νόσου και τη σχέση γονοτύπου/φαινοτύπου

Abstract

Following the identification in 2005 of the recurrent V617F mutation in exon 14 of JAK2 in Myeloproliferative Disorder (MPD) patients, many studies have confirmed the frequency of this mutation in distinct MPD subclasses. The presence of the JAK2 V617F mutation has proved even more useful to distinguish, in patients with true polycythaemia, those withPolycythaemia Vera (PV, 90% JAK2 V617F positive) from those with Idiopathic Erythrocytosis (IE, V617F-negative). The JAK2 V617F mutation is also present in about half of the patients with splanchnic vein thrombosis suggesting that occurrence of thrombosis in these patients is caused by an undiagnosed MPD.In my first study, we took advantage of our cohort of JAK2 V617F-negative patients and analyzed three distinct groups: two groups of patients with increased red cell mass, either with (PV) or without (IE) sufficient criteria for a diagnosis of PV, and one group of patients with splanchnic vein thrombosis. All patients had been previously found negative for the JAK2 V617F mutation using allele-specific real-time polymerase chain reaction (AS-PCR).Among 47 patients with an increased red cell mass (>25% excess), 26 fulfilled the Polycythaemia Vera Study Group (PVSG) or World Health Organization (WHO) criteria for PV at diagnosis, while 21 were classified as having IE on the basis of a raised red cell mass, with no identifiable cause of secondary erythrocytosis. Eight cases were found to carry an exon 12 mutation. Thus, JAK2 exon 12 mutations were detected in 31% of our JAK2V617F negative patients, with a preponderance of the N542-E543del mutant. This quite low percentage suggests that other genetic alterations may cause PV. In conclusion, the mutations in exon 12 are very useful markers to identify MPD patients. Their frequency, unlike the JAK2 V617F mutation, is low, suggesting that the search for JAK2 exon 12 mutations should be restricted to patients who fulfil PV diagnostic criteria, have low serum Epo levels and EECs and do not carry the JAK2 V617F mutation.In the next study, I studied the 46/1 haplotype in a cohort of 170 patients with SVT (sex ratio M/F _ 1.12). As controls we studied 58 non-MPN patients with peripheral vein thrombosis (PVT) and 31 patients with JAK2VF-positive polycythemia vera (PV). We studied 2 tag single-nucleotide polymorphisms (rs10974944 and rs12343867) on peripheral blood DNA using Taqman allelic discrimination assays. In 170 patients with SVT, the frequency of the 46/1 haplotype was 0.28 which is not significantly different from the published population controls from theWellcome Trust Case Control Consortium (WTCCC) (0.24; P_.11 by the Fisher exact test). In our study, concordantly with the literature, 10 mutant allele burden was_ 50% in 89% of patients (median: 19%) whereas in the study by Smalberg et al, JAK2VF allele burden was available in 45 patients only. In summary, in a larger cohort of JAK2VF-positive patients with comprehensive mutant allele burden data, we did not confirm the higher frequency of the 46/1 haplotype in SVT patients with MPNs found by Smalberg et al.The next prospective study aimed at assessing their incidence and response to therapy. Patients with essential thrombocythemia often complain of various subjective neurological symptoms. Among thirty-seven consecutive patients with essential thrombocythemia, 11 presented with neurological symptoms. Brain magnetic resonance imagery failed to detect any substratum in patients with subjective symptoms. JAK2V617F mutation was found in 9/11 patients with neurological symptoms versus 14/26 patients without symptoms. In this prospective cohort, 30% of patients with essential thrombocythemia presented neurological symptoms. Aspirin was fully efficient in only 30% of cases. JAK2V617F mutation could be a risk factor for such symptoms.

Τα Χρόνια Μυελοϋπερπλαστικά Σύνδρομα (ΧΜΥΣ) ή Χρόνια Μυελοϋπερπλαστικά Νεοπλάσματα (ΧΜΥΝ) περιλαμβάνουν μία σειρά κλωνικών αιματολογικών διαταραχών, οι οποίες προκύπτουν από τον αναίτιο, άσκοπο, και ανεξέλεγκτο πολλαπλασιασμό ενός ή περισσότερων αρχέγονων αιμοποιητικών κυττάρων. Στα ΧΜΥΝ, ανάλογα με το είδος του μυελικού κυττάρου, το οποίο υφίσταται την νεοπλαστική εξαλλαγή, υπάγονται οι ακόλουθες καταστάσεις: Χρόνια Μυελοκυτταρική Λευχαιμία, Αληθής Πολυκυτταραιμία, Ιδιοπαθής Θρομβοκυττάρωση και Χρόνια Μυελοϊνωση.Σε πρώτη φάση, μελετήθηκαν 47 ασθενείς που είχαν ερυθροκυτταρική μάζα πάνω από το 25% του φυσιολογικού, αλλά δεν είχαν την μετάλλαξη JAK2V617F. 26 από αυτούς πληρούσαν τα κριτήρια της Ομάδας Μελέτης της Αληθούς Πολυκυτταραιμίας (Polycythemia Vera Study Group) ή τα κριτήρια της Παγκόσμιας Οργάνωσης Υγείας (WHO), ενώ οι υπόλοιποι 21 είχαν “ιδιοπαθή ερυθροκυττάρωση”. Μεταλλάξεις στο εξόνιο 12 βρέθηκαν σε 8 ασθενείς. Επτά από αυτούς έφεραν την μετάλλαξη Ν542-Ε543del και ένας την μετάλλαξη K539L. Οι άλλες μεταλλάξεις του εξονίου 12 δεν ανιχνεύθηκαν. Δύο θετικοί ασθενείς πληρούσαν τα κριτήρια της αληθούς πολυκυτταραιμίας (κατά WHO και PVSG), δηλαδή, εκτός από την αύξηση της μάζας των ερυθροκυττάρων, εμφάνιζαν και αύξηση των λευκών και των αιμοπεταλίων, ενώ ένας ακόμη ασθενής εμφάνιζε σημαντική αύξηση μόνον των λευκών. Συνεπώς, η παρουσία της μετάλλαξης στο εξόνιο 12, δεν οδηγεί σταθερά σε μεμονωμένη υπερπλασία της ερυθράς σειράς, αλλά μπορεί κάλλιστα να περιλάβει και αύξηση των δύο άλλων κυτταρικών σειρών του αίματος. Επίσης, αναλύθηκε το DNA 23 ασθενών που είχαν εμφανίσει σπλαχνική φλεβική θρόμβωση, οκτώ με Budd-Chiari σύνδρομο και 15 με φλεβική πυλαία θρόμβωση, οκτώ θήλεις και 14 άρρενες, με μέση ηλικία 53 έτη και μέση τιμή αιματοκρίτη 40%. Μεταλλάξεις του εξονίου 12 δεν διαπιστώθηκαν σε κανέναν από αυτούς.Στη συνέχεια αναλύθηκε το DNA από 226 δείγματα ασθενών με ιστορικό σοβαρής σπλαγχνικής θρόμβωσης [θρόμβωση μεσεντερίου, σπληνικής, πυλαίας και ηπατικών φλεβών (Budd Chiari) ή άλλης περιφερικής θρόμβωσης, τα οποία συγκρίθηκαν με δείγματα DNA από 30 κατά τεκμήριο υγιείς μάρτυρες. Η ομάδα των ασθενών με ιστορικό θρόμβωσης περιέλαβε 75 ασθενείς με διάφορα μυελοϋπερπλαστικά νοσήματα που ήταν JAK2V617F θετικοί και 95 ασθενείς με διάφορα μυελοϋπερπλαστικά νοσήματα που ήταν JAK2V617F αρνητικοί. Εικοσιτρείς (23) από τους πρώτους ασθενείς είχαν διαγνωσθεί ως τυπική πρωτοπαθής πολυκυτταραιμία (ΡV), ενώ οι υπόλοιποι 52 έπασχαν από ιδιοπαθή θρομβοκυττάρωση ή μυελοϊνωση. Από την δεύτερη ομάδα (JAK2V617F αρνητικοί ασθενείς με θρόμβωση) πρωτοπαθή πολυκυτταραιμία με τα κριτήρια ΠΟΥ/PVSG) είχαν μόνον 16 ασθενείς, από τους οποίους 5 είχαν μεταλλάξεις του εξονίου 12. Σε όλους τους παραπάνω ασθενείς αναζητήθηκε ο πολυμορφισμός C / G στην ομόζυγη αρχική μορφή (wild, CC), την ετερόζυγη μορφή (CG) και την ομόζυγη μεταλλαγμένη μορφή (mutant,GG). Οι συχνότητες των απλότυπων CC, CG και GG στο σύνολο των 170 ασθενών με σπλαγχνική φλεβική θρόμβωση βρέθηκαν 52, 67, και 8 % αντίστοιχα, και δεν εμφάνιζαν καμία στατιστικά σημαντική διαφορά μεταξύ των 75 V617F θετικών και των 95 V617F αρνητικών ασθενών. Η συχνότητα του G αλληλίου στις παραπάνω τρείς ομάδες ήταν 0.28, 0.27 και 0.28 αντίστοιχα, ενώ η συχνότητα του απλότυπου 46/1 υπολογίσθηκε σε 48, 47 και 48 % αντίστοιχα. Παρόμοια αποτελέσματα έδωκε η ομάδα των 58 ασθενών με περιφερικές φλεβικές θρομβώσεις, όπου η συχνότητα του απλότυπου 46/1 ήταν 38 % και η αντίστοιχη συχνότητα του αλληλίου G 0.22. Αντίθετα, η συχνότητα του απλότυπου 46/1 ήταν σαφώς αυξημένη στην ομάδα των 31 ασθενών με αληθή πολυκυτταραιμία και μεταλλαγμένο γονίδιο JAK2V617F, ανεξάρτητα από την ύπαρξη ή όχι ιστορικού θρόμβωσης (77% με αντίστοιχη συχνότητα αλληλίου G : 0.52). H διαφορά αυτή ήταν στατιστικά σημαντική (Ρ : 0.0005).Επίσηςμ μελετήθηκαν 29 ασθενείς, 11 γυναίκες και 18 άνδρες διαφόρων ηλικιών. Εξ’ ορισμού, ο αιματοκρίτης των ασθενών ήταν υψηλότερος του 52 % (φ.τ. 47.0 ± 5.0) (εύρος τιμών 52-69%) εκτός από 3 ασθενείς, οι οποίοι είχαν ήδη υποστεί αφαιμάξεις και είχαν τιμές αιματοκρίτη από 42 έως 50%. Σε 16 ασθενείς η ερυθροκυττάρωση συνοδεύονταν από Θρομβοκυττάρωση (ΑΜΠ > 600,000/μL), η οποία ξεπερνούσε το εκατομμύριο σε τρείς περιπτώσεις. Τα λευκά αιμοσφαίρια κυμαίνονταν από 10 έως 20,000/μL. H ερυθροποιητίνη ορού μετρήθηκε σε λίγους ασθενείς και ήταν σταθερά χαμηλή, όπως ήταν αναμενόμενο. Η μάζα των ερυθρών μετρήθηκε με την μέθοδο του ραδιοχρωμίου, όπου ένας συγκεκριμένος όγκος ερυθρών επωάζεται παρουσία ραδιοχρωμίου (51Cr) και επανενίεται στον εξεταζόμενο, αφού προσδιορισθεί η ραδιενέργεια την οποία εκπέμπει. Η συσχέτιση των παραπάνω παραμέτρων, δηλαδή η σχέση φορτίου νόσου προς αιματοκρίτη και προς μάζα ερυθρών έγινε με το στατιστικό πρόγραμμα GraphPad Prism. Συγκεκριμένα, διαπιστώνεται στατιστικά σημαντική συσχέτιση μεταξύ ποσοστού JAK2V617F και αιματοκρίτη (r : 0,5123, P : 0,0045) και εξ ίσου σημαντική συσχέτιση μεταξύ ποσοστού JAK2V617F και μάζας ερυθρών ( r : 0,6875, P : 0, 0001). Επίσης διαπιστώνεται θετική στατιστικά σημαντική συσχέτιση μεταξύ ποσοστού JAK2V617F και λευκών αιμοσφαιρίων (r : 0,7543, P : 0,0003), ενώ η συσχέτιση ποσοστού JAK2V617F και αριθμού αιμοπεταλίων δεν είναι στατιστικά σημαντική (r : - 0, 2134, P : 0,3529). Παρεπιμπτόντως, διαπιστώνεται επίσης θετική, στατιστικά σημαντική συσχέτιση μεταξύ αιματοκρίτη και μάζας ερυθρών, όπως άλλωστε αναμένεται ( r : - 0, 6011, P : 0,0006).Τέλος, μελετήθηκαν 37 ασθενείς που είχαν πρόσφατα διαγνωστεί με ιδιοπαθή θρομβοκυττάρωση, 11 άνδρες και 26 γυναίκες. Διακρίθηκαν δύο ομάδες. Η πρώτη με νευρολογικά συμπτώματα/ ευρήματα (11 ασθενείς, 5 άνδρες και 7 γυναίκες) και η δεύτερη χωρίς αυτά (26 ασθενείς, 7 άνδρες και 18 γυναίκες). Κατά κανόνα, οι ασθενείς με νευρολογικά συμπτώματα/ευρήματα ήταν νεότεροι (διάμεση ηλικία 47 έτη) από αυτούς που δεν είχαν (διάμεση ηλικία 58 έτη). Ο διάμεσος αριθμός των αιμοπεταλίων στην διάγνωση ήταν 860 και 750 x 109/L αντίστοιχα.Τα νευρολογικά συμπτώματα που καταγράφηκαν ήταν “θρομβωτικά” σε 4 περιπτώσεις, από τις οποίες 3 παροδικά ισχαιμικά επεισόδια και μια φλεβική θρόμβωση, και τελείως υποκειμενικά στις υπόλοιπες 7. Στην πλειοψηφία των ασθενών της δεύτερης ομάδας τα συμπτώματα ήταν πάντα παροδικά με διάρκεια λίγα δευτερόλεπτα έως μερικά λεπτά. Η νευρολογική εξέταση δεν απεκάλυψε καμία ανωμαλία. Η Μαγνητική τομογραφία εγκεφάλου (που έγινε σε 9 / 11 ασθενείς ) δεν μπόρεσε να εντοπίσει κάποια αιτία για αυτά τα συμπτώματα, ακόμη και με ακολουθίες διάχυσης (που πραγματοποιήθηκαν σε 7/9 ασθενείς). Τα κλινικά και αιματολογικά χαρακτηριστικά (φύλο, ηλικία, παράγοντες κινδύνου, επίπεδα αιμοσφαιρίνης, λευκών και αιμοπεταλίων) στις δύο ομάδες ασθενών (11 ασθενείς με θρομβοκυττάρωση και νευρολογικό πρόβλημα σε σύγκριση με 26 ασθενείς χωρίς νευρολογικά συμπτώματα) δεν έδειξαν στατιστικά σημαντικές διαφορές. Η JAK2V617F μετάλλαξη ανιχνεύθηκε σε 9/11 ασθενείς της πρώτης ομάδας (82%, ασθενείς με νευρολογικά συμπτώματα) έναντι 14/26 (54%) στους ασθενείς χωρίς συμπτώματα (p : 0,15). Η θεραπευτική απάντηση στην ασπιρίνη (ASA) ήταν ετερογενής, επέφερε όμως πλήρη ύφεση των νευρολογικών συμπτωμάτων σε 5/10 (50%) ασθενείς και βελτίωση (μείωση των παροδικών επεισόδια) σε 3/10 (30%). Δύο ασθενείς (20%) δεν έδειξαν να βοηθούνται από την ASA και έλαβαν υδροξυουρία. Ο ενδέκατος ασθενής ελάμβανε ήδη ασπιρίνη και δεν περιλήφθηκε στην αξιολόγηση. Εν κατακλείδι, τα πρόσφατα δημοσιευμένα στοιχεία μας καθώς και οι υπόλοιπιες δηόσιεύσεις αντίστοιχων ομάδων δείχνουν ότι οι μεταλλάξεις στο εξόνιο 12 αποτελούν πολύ χρήσιμους δείκτες για τη διάγνωση ασθενών με ΧΜΥΣ. Η συχνότητά τους, σε αντίθεση με μετάλλαξη JAK2V617F, είναι χαμηλή, γεγονός που υποδηλώνει ότι η αναζήτηση των μεταλλάξεων στο JAK2 Exon 12 θα πρέπει να περιορίζεται σε ασθενείς που πληρούν τα διαγνωστικά κριτήρια της ΑΠ, έχουν χαμηλά επίπεδα ορού ΕΡΟ και να μην έχουν τη μετάλλαξη JAK2V617F. Στη δεύτερη μελέτη, η ομάδα μας δεν διαπίστωσε καμία αύξηση της συχνότητας του απλοτύπου 46/1 σε ασθενείς με φλεβική σπλαγχνική θρόμβωση, όπως αναφέρεται στη μελέτη των Smalberg και συν. Τέλος, στη μελέτη των 37 ασθενών με ιδιοπαθή θρομβοκυττάρωση, η συχνότητα των νευρολογικών συμπτωμάτων ήταν 30%. Η Μαγνητική τομογραφία εγκεφάλου ήταν πάντα κανονική σε ασθενείς με συμπτώματα που υποδηλώνουν υποκειμενικά ότι, η μαγνητική τομογραφία δεν είναι χρήσιμη στην αξιολόγηση των ασθενών με άτυπα νευρολογικά συμπτώματα κατά τη διάγνωση, μετά από προσεκτικό αποκλεισμό εκείνων με εστιακά νευρολογικά ελλείμματα. Η απάντηση στην ασπιρίνη ήταν ετερογενής, όπου μόνο το 30% των ασθενών εμφάνισαν υποχώρηση των συμπτωμάτων τους. Η προσθήκη κυτταροστατικής θεραπείας είναι απαραίτητη σε αυτούς τους ασθενείς. Η ύπαρξη της μετάλλαξης JAK2V617F θα μπορούσε να αποτελεί ένα παράγοντα κινδύνου για νευρολογικά συμπτώματα στους ασθενείς με ιδιοπαθή θρομβοκυττάρωση. Κάτι τέτοιο θα πρέπει να επιβεβαιωθεί σε μια μεγαλύτερη ομάδα ασθενών.