Μελέτη του Β κυτταρικού υποδοχέα σε κακοήθη λεμφοϋπερπλαστικά νοσήματα

Abstract

The present doctorate thesis is divided in three different sections dealing with the analysis of B cell receptors in both malignant as well as non-malignant B cell populations. 1IMMUNOGENETIC ANALYSIS OF SPLENIC MARGINAL ZONE LYMPHOMAWe performed an immunogenetic analysis of 345 IGHV-IGHD-IGHJ rearrangements from 337 cases with primary splenic small B-cell lymphomas of marginal-zone origin. Three IGHV genes accounted for 45.8% of cases (IGHV1-2: 24.9%; IGHV4-34: 12.8%; IGHV3-23: 8.1%). Particularly for the IGHV1-2 gene, strong biases were evident regarding the utilization of different alleles, with 79/86 rearrangements (92%) utilizing allele *04. Among cases more stringently classified as splenic marginal-zone lymphoma (SMZL) thanks to the availability of splenic histopathological specimens, the frequency of IGHV1-2*04 peaked at 31%. The IGHV1-2*04 rearrangements carried significantly longer complementarity-determining region-3 (CDR3) than all other cases and exhibited biased IGHD gene usage, leading to CDR3s with common motifs. The great majority of analyzed rearrangements (299/345; 86.7%) carried IGHV genes with some impact of somatic hypermutation, from minimal to pronounced. Noticeably, 75/79 (95%) IGHV1-2*04 rearrangements were mutated; however, they mostly (56/75 cases; 74.6%) carried few mutations (97-99.9% germline identity) of conservative nature and restricted distribution. These distinctive features of the IG receptors indicate selection by (super)antigenic element(s) in the pathogenesis of SMZL. Furthermore, they raise the possibility that certain SMZL subtypes could derive from progenitor populations adapted to particular antigenic challenges through selection of VH domain specificities, in particular the IGHV1-2*04 allele.2INTRACLONAL DIVERSIFICATION OF CLONOTYPIC IGHV1-2*04 IMMUNOGLOBULIN RECEPTORS IN SPLENIC MARGINAL-ZONE LYMPHOMAThe remarkable repertoire biases in SMZL, namely the utilization of the *04 allele of the IGHV1-2 gene, combined with the existence of distinctive molecular characteristics including (i) high rearrangement frequency with the IGHD3-3 and IGHD3-22 genes, however not leading to a corresponding increase in the frequency of VH CDR3 stereotypy, and (ii) limited impact of somatic hypermutation, that nevertheless were of a “recurrent” nature, raise questions concerning the occurrence and type of a possible antigenic stimulation. These issues are investigated in the context of the present study by sub-cloning of the IGHV/IGHD/IGHJ rearrangements, in searching for evidence of intraclonal diversification (ID). The study group comprised eleven cases classified as SMZL based on histopathological findings of spleen (n=10) or bone marrow (n=1) biopsy specimens. All patients carried clonotypic IGHV1-2*04 rearrangements, “coupled” with IGHD3-3 and IGHD3-22 genes, in six and two cases respectively. All rearrangements were characterized by long VH CDR3 regions, ranging from 19 to 27 amino acids (median length: 21 amino acids). With the exception of a single rearrangement that had low germline identity (93.1%), all remaining rearrangements carried a limited number of mutations along the VH domain, showing a median germline identity of 98.3%. We analyzed a total of 201 rearrangement sub-clones, 8-28 per case (median number of sub-cloned sequences per case: 18). We identified confirmed mutations (mutations present in at least two sub-clones of a certain case) in 10/11 cases, which we considered as showing intraclonal diversification. In total, we confirmed 60 distinct mutations at 51 positions along the variable region, as two different nucleotide changes were reported in seven positions, whereas in one position all three possible substitutions where observed. 39/60 substitutions (65%) resulted to an amino acid substitution (R), whereas the remaining 21/60 (35%) were silent (S). Extensive analysis of the distribution and characteristics of confirmed mutations revealed: (i) intraclonal diversification patterns that were common among cases, in the sense of identification of the same mutation in rearrangement sub-clones of different patients, (ii) selective targeting of certain codons along the VH domain (especially, IMGT/HFR2-39) (iii) amino acid replacements of a conservative nature, in the sense that the incoming amino acid displayed the same physicochemical properties with the original residue, (iv) limited diversification of the VH CDR3 region. Additionally, in 5/11 cases, sub-cloned rearrangements could be classified into two distinctive groups. The latter may be taken as a hint of a primary branching of the clonal population into subpopulations carrying distinctive mutational patterns. In conclusion: (i) we confirmed the existence of intraclonal diversification among a sub-group of SMZL patients utilizing IGHV1-2*04 rearrangements, regardless of the mutational status; (ii) we documented that intraclonal diversification in at least this specific subgroup of SMZL patients is a driven rather than a coincidental process; (iii) we provided evidence implying the role of antigenic stimulation not only in selecting the clonogenic progenitors but also in driving the malignant cells themselves. 3IMMUNOGENETIC ANALYSIS OF IGHV-IGHD-IGHJ REARRANGEMENTS IN DISTINCT MEMORY B CELL POPULATIONS DERIVING FROM HEALTHY DONORSMultiple distinct memory B cell subsets have been identified in humans, but it remains unclear how their phenotypic diversity corresponds to the type of responses they originate from. We defined six memory B cell subsets based on their antigen-experienced phenotype and differential expression of CD27 and IgH isotypes. Differential immunogenetic analysis of their B cell receptors, revealed (i) distinctive repertoires of IGHV, IGHD and IGHJ genes (ii) differences concerning the impact of somatic hypermutation process (iii) differences in the distribution of the mutations between each subpopulation as well as among cases of each subpopulation utilizing IGHV genes of the same group (i.e. IGHV1, IGHV3, IGHV4 etc.) and (iv) differences concerning the VH CDR3 characteristics of each subpopulation, namely VH CDR3 length. The results mentioned here provide evidence supporting the possibility that these distinct subsets originate from different pathways and provide new opportunities to study these processes in immunological diseases.

Η παρούσα διδακτορική διατριβή περιλαμβάνει τρεις διακριτές ενότητες στις οποίες πραγματοποιείται μελέτη των αντιγονικών υποδοχέων των Β λεμφοκυττάρων σε πληθυσμούς κακοήθων και φυσιολογικών Β λεμφοκυττάρων.1ΜΕΛΕΤΗ ΤΟΥ ΡΕΠΕΡΤΟΡΙΟΥ ΤΩΝ ΓΟΝΙΔΙΩΝ ΤΩΝ ΑΝΟΣΟΣΦΑΙΡΙΝΩΝ ΚΑΙ ΑΝΑΛΥΣΗ ΤΩΝ ΜΟΡΙΑΚΩΝ ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΤΙΚΩΝ ΤΟΥ ΜΗΧΑΝΙΣΜΟΥ ΤΗΣ ΣΩΜΑΤΙΚΗΣ ΥΠΕΡΜΕΤΑΛΛΑΞΙΓΕΝΕΣΗΣ ΣΕ ΑΣΘΕΝΕΙΣ ΜΕ ΣΠΛΗΝΙΚΟ ΛΕΜΦΩΜΑ ΤΗΣ ΟΡΙΑΚΗΣ ΖΩΝΗΣΠραγματοποιήθηκε ανοσογενετική ανάλυση σε 345 αναδιατάξεις IGHV-IGHD-IGHJ που ενισχύθηκαν από 337 περιπτώσεις ασθενών με πρωτοπαθές σπληνικό λέμφωμα από μικρά Β λεμφοκύτταρα με προέλευση την οριακή ζώνη. Τρία γονίδια IGHV χρησιμοποιούνταν στο 45.8% των αναδιατάξεων (IGHV1-2: 24.9%, IGHV4-34: 12.8%, IGHV3-23: 8.1%). Ειδικότερα, για το γονίδιο IGHV1-2, ανιχνεύθηκε ισχυρή επιλεκτικότητα στο επίπεδο των διαφορετικών αλληλόμορφων του, καθώς σε 79 από τις συνολικά 86 αναδιατάξεις IGHV1-2 (92%) χρησιμοποιείται το αλληλόμορφο *04. Η συχνότητα αναδιάταξης του αλληλόμορφου IGHV1-2*04, στο υποσύνολο των περιπτώσεων που διαγνώστηκαν ως ΣΛΟΖ με βάση ανοσοϊστοχημική εξέταση υλικού σπληνεκτομής έφτασε στο 31%. Οι αναδιατάξεις IGHV1-2*04 χαρακτηρίζονταν από σημαντικά μακρύτερη περιοχή VΗ CDR3 σε σύγκριση με όλες τις υπόλοιπες περιπτώσεις κι εμφάνιζαν επιλεκτικότητα στη χρήση συγκεκριμένων γονιδίων IGHD που οδηγούσε στο σχηματισμό περιοχών CDR3 με κοινά αμινοξικά μοτίβα. Η πλειονότητα των αναδιατάξεων που αναλύθηκαν (299/345, 86.7%) ήταν μεταλλαγμένες. Ειδικότερα, 75/79 (95%) αναδιατάξεις του αλληλόμορφου IGHV1-2*04 ήταν μεταλλαγμένες, ωστόσο, οι περισσότερες από αυτές (56/75 cases, 74.6%) έφεραν λίγες μεταλλάξεις κι εμφάνιζαν 97-99.9% ταυτότητα με το μη αναδιαταγμένο αλληλόμορφο. Μάλιστα, οι μεταλλάξεις ήταν συντηρητικού χαρακτήρα κι επικεντρώνονταν σε συγκεκριμένες θέσεις της μεταβλητής περιοχής. Αυτά τα ιδιαίτερα χαρακτηριστικά των αντιγονικών υποδοχέων υποδηλώνουν την πιθανότητα συμμετοχής συγκεκριμένων (υπερ)αντιγόνων στην παθογένεση του ΣΛΟΖ. Επιπλέον, ενισχύουν την άποψη ότι ιδιαίτερα υποσύνολα περιπτώσεων ΣΛΟΖ, όπως το υποσύνολο με κλωνοτυπικές αναδιατάξεις IGHV1-2*04, προέρχονται από προγονικούς κυτταρικούς πληθυσμούς που φέρουν αντιγονικούς υποδοχείς με περιορισμένο εύρος ειδικοτήτων, καθώς έχουν προσαρμοστεί στην αντιμετώπιση συγκεκριμένων αντιγονικών προκλήσεων.2ΜΕΛΕΤΗ ΕΝΔΟΚΛΩΝΙΚΗΣ ΕΤΕΡΟΓΕΝΕΙΑΣ ΣΕ ΑΣΘΕΝΕΙΣ ΜΕ ΣΠΛΗΝΙΚΟ ΛΕΜΦΩΜΑ ΤΗΣ ΟΡΙΑΚΗΣ ΖΩΝΗΣ ΜΕ IGHV1-2*04 ΚΛΩΝΟΤΥΠΙΚΟΥΣ ΥΠΟΔΟΧΕΙΣΗ εντυπωσιακή επιλεκτικότητα ρεπερτορίου στο ΣΛΟΖ, μ’ επικράτηση του γονιδίου IGHV1-2 και μάλιστα συγκεκριμένου αλληλόμορφου (*04), και τα ιδιαίτερα μοριακά χαρακτηριστικά τους (επιλεκτική χρησιμοποίηση των γονιδίων IGHD3-3 και IGHD3-22, χωρίς όμως αυξημένη συχνότητα VH CDR3 στερεοτυπίας, αυξημένο μήκος της περιοχής VH CDR3 και περιορισμένο φορτίο σωματικών μεταλλάξεων με χαρακτηριστικές αμινοξικές αντικαταστάσεις), εγείρουν ερωτήματα αναφορικά με το ενδεχόμενο και τον τύπο της αντιγονικής διέγερσης, τα οποία εξετάζονται με την προσέγγιση της υποκλωνοποίησης των αναδιατάξεων V(D)J για την αναζήτηση ενδοκλωνικής ετερογένειας (ΕΕ). Η ομάδα μελέτης περιλάμβανε 11 ασθενείς με ΣΛΟΖ τεκμηριωμένο σε υλικό σπληνεκτομής (n=10) ή οστεομυελικής βιοψίας (n=1), οι οποίοι εξέφραζαν κλωνοτυπικές αναδιατάξεις IGHV1-2. Έξι και 2 αναδιατάξεις, αντιστοίχως, χρησιμοποιούσαν τα γονίδια IGHD3-3 και IGHD3-22. Οι περιοχές VH CDR3 εμφάνιζαν αυξημένο μήκος (διάμεσο μήκος: 21 αμινοξέα, εύρος: 19-27). Εκτός από μια αναδιάταξη με νουκλεοτιδική ταυτότητα 93.1%, οι υπόλοιπες εμφάνιζαν λίγες μεταλλάξεις (διάμεση νουκλεοτιδική ταυτότητα: 98.3%). Συνολικά αναλύθηκαν 201 υποκλώνοι, 8-28 ανά περίπτωση (διάμεση τιμή: 18). Δέκα από τις 11 αναδιατάξεις που αναλύθηκαν έφεραν επιβεβαιωμένες μεταλλάξεις (μεταλλάξεις που εμφανίζονταν τουλάχιστον σε δύο υποκλώνους) και θεωρήθηκε ότι εμφανίζουν ΕΕ. Επιβεβαιώθηκαν 60 διαφορετικές μεταλλάξεις σε 51 θέσεις κατά μήκος της μεταβλητής περιοχής, καθώς σε επτά θέσεις συνέβαιναν δύο διαφορετικές αλλαγές και σε μια συνέβαιναν και οι τρεις πιθανές αλλαγές. 39/60 μεταλλάξεις (65%) προκαλούσαν αντικατάσταση αμινοξέος (μεταλλάξεις αντικατάστασης, R), ενώ 21/60 (35%) ήταν σιωπηρές (S). Η ανάλυση της κατανομής και των ιδιοτήτων των επιβεβαιωμένων μεταλλάξεων ανέδειξε: (i) κοινά πρότυπα ΕΕ, υπό την έννοια της εισαγωγής ταυτόσημης μετάλλαξης σε υποκλώνους διαφορετικών ασθενών, (ii) έντονη στόχευση επιλεγμένων κωδικόνιων (ιδίως IMGT/HFR2-39), (iii) συντηρητικές αντικαταστάσεις, δηλαδή αντικατάσταση αμινοξέος από άλλο αμινοξύ της ίδιας λειτουργικής ομάδας, (iv) περιορισμένη παραλλακτικότητα στην περιοχή VH CDR3. Επίσης, σε 5/11 περιπτώσεις οι υποκλώνοι κατατάσσονταν σε δύο κύριες ομάδες, ένδειξη για πρώιμη «διακλάδωση» του κλωνικού πληθυσμού σε υποπληθυσμούς με ιδιαίτερα πρότυπα μεταλλάξεων. Συμπερασματικά: (i) επιβεβαιώνεται έντονη ΕΕ στην υποομάδα ασθενών με ΣΛΟΖ με κλωνοτυπικές ανοσοσφαιρίνες IGHV1-2*04, ανεξάρτητα από το φορτίο μεταλλάξεων, (ii) αποκαλύπτεται ότι η ΕΕ στο ΣΛΟΖ είναι κατευθυνόμενη και όχι τυχαία διεργασία, (iii) προκύπτουν ισχυρές ενδείξεις για το ρόλο της αντιγονικής διέγερσης όχι μόνο στην επιλογή των κλωνογενών κυττάρων αλλά και στην πορεία του νοσήματος. Συνεπώς, τα αποτελέσματα της παρούσας μελέτης ενισχύουν την άποψη ότι το ΣΛΟΖ προέρχεται από νεοπλασματική εξαλλαγή ενός αντιγονικά έμπειρου κυττάρου, τουλάχιστον στο υποσύνολο ασθενών με ανοσοσφαιρίνες IGHV1-2.3ΑΝΟΣΟΓΕΝΕΤΙΚΗ ΑΝΑΛΥΣΗ ΤΩΝ ΑΝΑΔΙΑΤΑΞΕΩΝ IGHV-IGHD-IGHJ ΣΕ ΔΙΑΚΡΙΤΟΥΣ ΠΛΗΘΥΣΜΟΥΣ Β ΛΕΜΦΟΚΥΤΤΑΡΩΝ ΜΝΗΜΗΣ ΑΠΟ ΥΓΙΕΙΣ ΔΟΤΕΣΣτον άνθρωπο έχει ταυτοποιηθεί η ύπαρξη διακριτών υποπληθυσμών Β λεμφοκυττάρων μνήμης. Ωστόσο, προς το παρόν δεν έχει αποδειχθεί αν τα διαφορετικά φαινοτυπικά χαρακτηριστικά τους αντικατοπτρίζουν την προέλευσή τους από διαφορετικούς τύπους άνοσων απαντήσεων. Στα πλαίσια της μελέτης διακρίθηκαν έξι υποπληθυσμοί Β λεμφοκυττάρων μνήμης, με βάση το φαινότυπό τους και, ιδίως, τη διαφορική έκφραση του δείκτη CD27 και του ισότυπου της βαριάς αλυσίδας των ανοσοσφαιρινών. Η συγκριτική ανάλυση των μοριακών χαρακτηριστικών των Β κυτταρικών υποδοχέων αποκάλυψε (i) διαφορές στο ρεπερτόριο γονιδίων ΙGHV, IGHD και IGHJ, (ii) διαφορές στο βαθμό επίδρασης του μηχανισμού της σωματικής υπερμεταλλαξιγένεσης, (iii) διαφορετική κατανομή μεταλλάξεων τόσο μεταξύ όλων των αναδιατάξεων που ανήκουν σε διαφορετικούς υποπληθυσμούς, όσο και μεταξύ των αναδιατάξεων διαφορετικών υποπληθυσμών που χρησιμοποιούν γονίδια IGHV της ίδιας υποομάδας (π.χ. IGHV1, IGHV3, IGHV4) και (iv) διαφορές στα χαρακτηριστικά της περιοχής VH CDR3, ιδίως στο μήκος της. Τα αποτελέσματα της ανάλυσης παρέχουν ενδείξεις που υποδηλώνουν την πιθανότητα ότι τα διαφορετικά υποσύνολα Β λεμφοκυττάρων μνήμης δημιουργήθηκαν μέσω διαφορετικών μονοπατιών οντογένεσης και παρέχουν τη δυνατότητα μελέτης και συσχέτισης καθενός από αυτά με συγκεκριμένες διαταραχές του ανοσοποιητικού συστήματος.