Μελέτη της έκφρασης των ενζύμων και ομάδας γονιδίων που εμπλέκονται στο μεταβολισμό φαρμάκων και ξενοβιοτικών ουσιών σε όγκους εγκεφάλου

Abstract

We set out to study the expression profile of various genes and their respective proteins that are related to drug metabolism in human brain tumors. Brain tumor samples were collected only from newly diagnosed patients that hadn’t undergone previous radiation or chemotherapy. Using western blotting and quantitative real time PCR the protein and mRNA expression of aldehyde oxidase-1 (AOX1), glutathione-S-transferase (GSTs) -P, -T, M and cytochrome P450 1A1 (CYP1A1) were assessed. The gene expression profile of aldehyde dehydrogenase 3A1 (ALDH3A1) and cytochrome P450 1B1 (CYP1B1) were also evaluated. A total of 77 specimens were analyzed. We determined the expression of five proteins (CYP1A1, AOX1, GSTP, GSTT, and GSTM) in 54 surgical samples. We compared for any significant difference in the mean protein expression between meningiomas and astrocytomas. On average meningiomas expressed higher AOX1, GSTP and GSTM levels than astrocytomas (AOX: p=0,03, GSTP: p=0,009 and GSTM: p<0,001) but lower CYP1A1 levels (p=0,01). Correlation between the four degrees of malignancy (WHO I-IV) and the protein expression levels was evaluated. A significant negative correlation between malignancy grade and protein levels for AOX, GSTP and GSTM (p=0,002, p=0,004 and p=0,006 respectively) was reported. We also examined for any differences among the levels of the transcript product in a total of 47 tissue specimens. There were 20 meningiomas, 15 astrocytomas and 5 metastases. mRNA levels of CYP1B1, AOX1, GSTP1 and GSTM3 were significantly affected by the underlying pathology (p<0,05). Meningiomas had consistently higher mRNA levels than astrocytomas for the four abovementioned genes (UCYP1B1=33,5, p<0,001, UAOX1=14, p<0,001, UGSTP1=34, p<0,001 and UGSTM3=76,5, p=0,013). When comparing meningiomas with the metastasis group, the two genes that demonstrated the highest mRNA levels, namely AOX1 (M=12,81) and GSTM3 (M=7,89) retained their statistical significance in the difference between the two groups (UAOX1=5, p=0,001 and UGSTM3=8, p=0,002respectively). Lastly, the comparison among astrocytomas and adenocarcinomas only revealed a significant difference for the GSTP1 gene (UGSTP1=8, p=0,007). There was a significant negative correlation between malignancy grade and mRNA levels for AOX, GSTP1, GSTM3 and also for CYP1B1 (p=0,002, p=0,001, p=0,006 and p<0,001 respectively). For 32 samples, we were able to run both western and RT-PCR analysis. There is absolutely no correlation for any of the studied genes for the meningiomas group while there is one for AOX1 (p=0,011), GSTP1 (p=0,03), GSTM3 (p=0,02) in the astrocytomas group. We showed that the various CNS tumors show different patterns of drug metabolizing enzyme (DME) expression. Meningiomas exhibited significantly higher expression levels for the DMEs studied. For AOX1, GSTP and GSTM, this was shown on both a transcriptional and a translational level. For astrocytomas, we observed a correlation between mRNA levels and the translational product.

Ο σκοπός της παρούσης εργασίας είναι η μελέτη της έκφρασης μιας ομάδας γονιδίων και ενζύμων τα οποία εμπλέκονται στο μεταβολισμό χημειοθεραπευτικών φαρμάκων και μεταβολικών ουσιών. Συλλέχθησαν τεμάχια όγκων εγκεφάλου από ασθενείς οι οποίοι δεν είχαν προηγουμένως υποβληθεί σε χημειοθεραπεία ή ακτινοβολία. Με τη μέθοδο της ανοσοαποτύπωσης (western blotting) προσδιορίστηκαν τα επίπεδα πρωτεϊνικής έκφρασης και με τη μέθοδο qRT-PCR προσδιορίστηκαν τα επίπεδα mRNA της αλδεϋδικής οξειδάσης-1 (ΑΟΧ1), των S-τρανσφερασών της γλουταθειόνης (GSTs) -T, -P και -M και του κυτοχρώματος Ρ4501Α1 (CYP1A1). Για τα γονίδια αλδεϋδική αφυδρογενάση 3Α1 (ALDH3A1) και κυτόχρωμα 1Β1 (CYP1Β1) έγινε ανάλυση μόνο για τα επίπεδα mRNA. Μελετήθηκαν συνολικά 77 όγκοι εγκεφάλου. Μελετήθηκε η έκφραση των πρωτεϊνών ΑΟΧ1, CYP1A1, GSTP, GSTT και GSTM, από τα οποία οι δύο μεγαλύτερες ομάδες ήταν τα μηνιγγιώματα και τα αστροκυττώματα. Προκύπτει ότι οι πρωτεΐνες AOX1, GSTP και GSTM παρουσιάζουν στατιστικά σημαντικά υψηλότερα επίπεδα έκφρασης σε σχέση με τα αστροκυττώματα (ΑΟΧ1:p=0,01), GSTP: p=0,009, και GSTM: p<0,001) αλλά χαμηλότερα επίπεδα έκφρασης για το κυτόχρωμα 1Α1 (p=0,03). Η έκφραση της GSTT δεν παρουσίαζε στατιστικά σημαντική διαφορά ανάμεσα στις δύο ομάδες (p=0,176). Προέκυψε αρνητική συσχέτιση ανάμεσα στα επίπεδα πρωτεϊνικής έκφρασης και το βαθμό κακοήθειας κατά WHO (Ι-IV), για τα την ΑΟΧ1 (τ=-0,35, p=0,002), GSTP (τ=-0,32, p=0,004) και GSTM (τ=-0,31, p=0,006). Τα επίπεδα mRNA προσδιορίστηκαν για τα γονίδια CYP1A1, CYP1B1, ALDH3Α1, AOX1, GSTP1, GSTM3 και GSTT1 σε 47 δείγματα, με τις τρείς μεγάλες ομάδες να είναι τα μηνιγγιώματα (n=20), τα αστροκυττώματα (n=15) και οι μεταστάσεις (n=5). Η γονιδιακή έκφραση των CYP1B1, AOX1, GSTP1 και GSTM3 επηρεάστηκε σημαντικά από τον τύπο όγκου (p<0,05). Τα μηνιγγιώματα είχαν σταθερά υψηλότερα επίπεδα mRNA σε σχέση με τα αστροκυττώματα για τα ανωτέρω γονίδια. Για την ΑΟΧ1 και GSTM3 αυτή η διαφορά παρέμεινε και ανάμεσα στα μηνιγγιώματα και τις μεταστάσεις (UAOX1=5, p=0,001 και UGSTM3=8, p=0,002), ενώ η σύγκριση ανάμεσα σε αστροκυττώματα και μεταστάσεις αποκάλυψε στατιστικά σημαντική διαφορά μόνο για την GSTP1 (UGSTP1=8, p=0,007). Υπήρχε στατιστικά σημαντική αρνητική συσχέτιση ανάμεσα στο βαθμό κακοήθειας και τα επίπεδα του μεταγραφικού προϊόντος για τα γονίδια AOX, GSTP1, GSTM3 και CYP1B1 (p=0,002, p=0,001, p=0,006 και p<0,001 αντίστοιχα). Σε 32 δείγματα, για πέντε γονίδια (ΑΟΧ1, CYP1A1, GSTP1, GSTT1 και GSTM3) έγινε συσχέτιση ανάμεσα στα επίπεδα mRNA και πρωτεΐνης. Για τα μηνιγγιώματα, δεν υπήρξε συσχέτιση για τα πέντε γονίδια που μετρήθηκαν (p>0,05). Αντίθετα, στα αστροκυττώματα υπήρξε συσχέτιση ανάμεσα στην έκφραση του γονιδίου και της πρωτεΐνης, για τα γονίδια AOX1 (p=0,011), GSTP1 (p=0,03) και GSTM3 (p=0,02), όχι όμως και για τα CYP1A1 και GSTΤ1. Διαπιστώσαμε ότι οι διάφοροι όγκοι εγκεφάλου παρουσιάζουν διαφορετικά πρότυπα έκφρασης των γονιδίων και πρωτεϊνών μεταβολισμού φαρμάκων και ξενοβιοτικών ουσιών. Τα μηνιγγιώματα παρουσίασαν σημαντικά υψηλότερη έκφραση για τις πρωτεΐνες AOX, GSTP και GSTM, αλλά χαμηλότερη για το CYP1A1. Για την ΑΟΧ, GSTP και GSTM, αυτό κατεδείχθη τόσο σε μεταγραφικό όσο και σε μεταφραστικό επίπεδο. Παρατηρήθηκε συσχέτιση ανάμεσα στα επίπεδα πρωτεΐνης που παράγονται και τα επίπεδα mRNA για τους αστροκυτταρικούς όγκους, όχι όμως για τα μηνιγγιώματα.