Επίδραση κυτταροστατικών φαρμάκων σε σχήματα προσομοιώσης μετρονομικής θεραπείας σε ανθρώπινα ενδοθηλιακά κύτταρα: in vitro μεταφραστική μελέτη κλινικής εφαρμογής μετρονομικής βινορελμπίνης

Abstract

A chemotherapy dosing strategy that attracts growing clinical interest is low dose metronomic chemotherapy. It involves the close, regular administration of conventional chemotherapeutic drugs without prolonged drug free intervals over extended periods of time. In contrast with conventional chemotherapy of maximum tolerated dose (MTD), the primary target of metronomic chemotherapy is thought to be tumor’s neovasculature. Angiogenesis, as the pioneer in the field Judah Folkman suggested in one of his latest papers, plays in cancer the role of ‘organizing principle’ because of its critical role in malignant tumor development. In this context angiogenesis is understood as a tumor supporting process, which is kept up aberrantly active through the influence of counterbalancing proteins that are produced by cancer cells and the microenvironment and drive endothelial cells functional and proliferating. In view of that, antiangiogenic cancer therapy optimally aims to inhibit proliferation and function of activated endothelial cells and thereof tackle cancer progression on a chronic basis. Among different classes of cytotoxics, microtubule disruptors are considered most appropriate for metronomic low-dose antiangiogenic chemotherapy because of their potency to inhibit proliferation and also function of endothelial cells at very low concentrations. Recently, availability of oral formulation of microtubule disrupting vinorelbine (Navelbine Soft Capsules®) led to clinical investigation of this drug at a metronomic dosing schedule [NCT00278070]. In this context we investigated functional and molecular effects of vinorelbine (VRL) against proliferating human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) in an experimental in vitro simulation of conventional and metronomic chemotherapy.In regard to induced changes in angiogenesis signaling genes under the influence of protracted and short exposure to VRL we studied interleukin-8 (IL-8), cyclooxygenase-2 (COX-2), thrombospondin-1 (TSP-1), the nuclear peroxisome proliferator-activated receptor gamma (PPARγ) and the cytoplasmic receptors CD36, and finally the transcription factors NF-κB and HIF-1α. Also, we studied the antiproliferative and the molecular effects of rosiglitazone in combination with metronomic vinorelbine on proliferating endothelial cells and investigate the role of PPARγ in the metronomic model.In this study, we used primary human umbilical cord vein (HUVEC) cells, which were isolated from human umbilical cord veins. HUVECs were plated to sub-confluence in plates coated with collagen and treated with VRL, RSG or the combination for 4, 24 and 96hrs. In the 96hr experiment, to simulate a metronomic dosing schedule we replaced the drug-enriched medium every 24hrs. In contrast, the treatment with VRL for 4hrs with a wash out period with drug-free medium for the consecutive 92hrs, and the 24hr time point simulate the classic schedule of chemotherapy with the Maximum Tolerated Dose (MTD). Initially, with the MTS Assay method we investigated the inhibition of cell proliferation and calculated IC50. By qRT-PCR, ELISA and Western blot we measured gene and protein expression of markers of angiogenesis, while with flow cytometry we studied apoptosis and cell cycle of HUVECs.The metronomic administration of vinorelbine was significantly more active in inhibiting proliferation of HUVEC compared to the short exposure with comparative difference of four orders of magnitude (IC50: 1,23nM vs. 32mM). Still, it did not affect cell cycle progression or induced cell apoptosis. Moreover, metronomic vinorelbine was shown to induce the expression of PPARγ and CD36 and inhibit the expression of angiogenic factors such as IL-8 and COX-2.Co-administration of metronomic vinorelbine with rosiglitazone was found to improve the antiangiogenic effects and increase the expression of PPAR even at concentrations previously inhibited his expression. Furthermore, coadministration of the two drugs conserved angiogenic factors in low, basic levels. Finally, synergistic effect of the two drugs was observed in inhibiting proliferation of the endothelial cells.In conclusion, metronomic vinorelbine inhibits proliferation of endothelial cells and suppresses molecular mechanisms of angiogenesis, mainly affecting the expression of PPARγ and IL-8 in enthothelial cells. IL-8 seems to be a metronomic vinorelbine therapy mediator. The activation of the nuclear receptor PPARγ by metronomic chemotherapy opens the way for the creation of co-administration studies of metronomic chemotherapy with activators of PPARγ in order to identify his exact role. Generally, the metronomic chemotherapy emerges as a promising alternative in the treatment of cancer, with satisfactory results. However, many studies are still needed to reveal the mechanisms involved in its anticancer actions.

Η θεραπευτική αντιμετώπιση του καρκίνου βασίζεται στη χορήγηση κυτταροστατικών φαρμάκων σε μέγιστες ανεκτές δόσεις ανά τακτά χρονικά διαστήματα, με στόχο την αναστολή του πολλαπλασιασμού των ταχέως αναπτυσσόμενων καρκινικών κυττάρων. Όμως, εκτός από τη καταστροφή των καρκινικών κυττάρων, δημιουργούνται φθορές και στα φυσιολογικά κύτταρα του οργανισμού, με αποτέλεσμα την εμφάνιση αρκετών παρενεργειών. Επιπρόσθετα, οι μέχρι τώρα θεραπευτικές επιλογές δεν έχουν προσφέρει σημαντικό κλινικό όφελος στην αντιμετώπιση των περισσοτέρων τύπων προχωρημένου ή μεταστατικού καρκίνου. Έτσι, η επιστημονική κοινότητα στράφηκε σε νεότερα πεδία έρευνας όπως η αγγειογένεση και η μετρονομική χημειοθεραπεία.Ο όρος Μετρονομική Χημειοθεραπεία χαρακτηρίζει δοσολογικά σχήματα χημειοθεραπείας σε συχνή, αδιάλειπτη χορήγηση υποτοξικών δόσεων κυτταροστατικών φαρμάκων σε μακροχρόνια βάση. Η στρατηγική αυτή στοχεύει κατά κύριο λόγο στα ενεργοποιημένα, πολλαπλασιαζόμενα ενδοθηλιακά κύτταρα των αγγείων των όγκων παρά στα καρκινικά κύτταρα. Σύμφωνα λοιπόν, με επιστημονικά δεδομένα η μετρονομική χημειοθεραπεία ενεργεί μέσω μηχανισμών αναστολής του πολλαπλασιασμού των ενδοθηλιακών κυττάρων των αγγείων των όγκων και ρύθμισης της ισορροπίας των αγγειογενετικών παραγόντων.Σκοπό της παρούσας ερευνητικής διατριβής απετέλεσε η διερεύνηση της κυτταρικής και μοριακής δράσης της VRL (Navelbine®) επί πολλαπλασιαζόμενων ανθρώπινων ενδοθηλιακών κυττάρων σε σχήματα που προσομοιάζουν με αυτά της μετρονομικής θεραπείας στην κλινική της εφαρμογή. Επίσης, η επίδραση της VRL σε κύριους μηχανισμούς που διέπουν την αγγειογένεση στο παραπάνω in vitro μοντέλο αποτέλεσε σημαντικό ερευνητικό στόχο. Επιπλέον στόχοι του ερευνητικού έργου ήταν η μελέτη του ρόλου του υποδοχέα PPARγ στο μοντέλο της in vitro μετρονομικής χημειοθεραπείας ενδοθηλιακών κυττάρων, και οι αλλαγές που προκαλεί στο μετρονομικό προφίλ της VRL η συγχορήγηση με ενεργοποιητές του PPARγ (ροσιγλιταζόνη) ως προς την αναστολή του πολλαπλασιασμού και της αγγειογένεσης.Υλικό της συγκεκριμένης μελέτης αποτέλεσαν τα ανθρώπινα ενδοθηλιακά κύτταρα (HUVEC) που απομονώθηκαν από την ομφαλική φλέβα ομφάλιου λώρου και καλλιεργήθηκαν σε κατάλληλο θρεπτικό υλικό που περιείχε βινορελμπίνη, τον μεταβολίτη ή ροσιγλιταζόνη ή και τον συνδυασμό τους, σε συγκεντρώσεις που κυμαίνονταν από 0,001nM μέχρι 100μΜ για 4, 24 και 96 ώρες. Αρχικά, με τη μέθοδο MTS Assay διερευνήθηκε η αναστολή του κυτταρικού πολλαπλασιασμού και υπολογίστηκε η μεσομέγιστη ανασταλτική συγκέντρωση (IC50). Με την μέθοδο qRT-PCR, ELISA και Western blot μετρήθηκε η γονιδιακή και η πρωτεϊνική έκφραση δεικτών αγγειογένεσης, ενώ με κυτταρομετρία ροής μελετήθηκε η απόπτωση και ο κυτταρικός κύκλος.Η μετρονομική χορήγηση VRL βρέθηκε σημαντικά πιο δραστική στην αναστολή πολλαπλασιασμού των HUVEC σε σχέση με την βραχεία έκθεση με συγκριτική διαφορά τεσσάρων τάξεων μεγέθους (IC50: 1,23nM vs. 32μΜ). Παρόλα αυτά δεν επηρέασε την εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου και δεν προκάλεσε απόπτωση των HUVEC. Επιπλέον, σε μετρονομικούς χρόνους και συγκεντρώσεις η VRL έδειξε να επάγει την έκφραση των αγγειοκατασταλτικών γονιδίων PPARγ και CD36 ενώ ταυτόχρονα αναστέλλει την έκφραση των αγγειογενετικών παραγόντων IL-8 και COX-2. Η IL-8 αποτελεί σημαντικό ρυθμιστή της μετρονομικής VRL in vitro αλλά και in vivo καθώς τα χαμηλά επίπεδα πριν τη μετρονομική θεραπεία με VRL καθορίζουν τους ασθενείς που θα ωφεληθούν από την συγκεκριμένη θεραπεία.Η συγχορήγηση της μετρονομικής VRL με τη ροσιγλιταζόνη βρέθηκε να βελτιώνει τα αντιαγγειογενετικά αποτελέσματα, καθώς αυξάνει την έκφραση του PPARγ ακόμα και στις συγκεντρώσεις που προηγουμένως ανέστειλαν την έκφρασή του. Επιπλέον, με τη συγχορήγηση έχουμε διατήρηση των αγγειογενετικών παραγόντων σε βασικά, χαμηλά επίπεδα. Τέλος συνεργική δράση των δυο φαρμάκων παρατηρήθηκε και στην αναστολή του πολλαπλασιασμού.Συμπερασματικά σε ένα in vitro μοντέλο μετρονομικής χημειοθεραπείας η VRL αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό των ενδοθηλιακών κυττάρων και επηρεάζει κατασταλτικά τους μοριακούς μηχανισμούς της αγγειογένεσης με σημαντικότερη δράση στο μονοπάτι του PPARγ και της IL-8. Η ενεργοποίηση του πυρηνικού υποδοχέα PPARγ από τη μετρονομική χημειοθεραπεία ανοίγει το δρόμο για τη δημιουργία μελετών συγχορήγησης μετρονομικής χημειοθεραπείας με ενεργοποιητές του PPARγ, έτσι ώστε να διερευνηθεί καλύτερα κ εις βάθος ο ρόλος του. Γενικότερα, η μετρονομική χημειοθεραπεία προβάλλει ως μια υποσχόμενη εναλλακτική στη θεραπευτική αντιμετώπιση του καρκίνου, με ικανοποιητικά αποτελέσματα. Όμως, χρειάζονται ακόμα πολλές μελέτες για να αποκαλυφθούν οι μηχανισμοί που εμπλέκονται σε αυτήν.