Σύνθεση και μελέτη μαγνητικών νανοφορέων με δυνατότητα πρόσδεσης σε βήτα αμυλοειδές: υπερπαραμαγνητικά νανοσωματίδια οξείδίου του σιδήρου με επικάλυψη πυριτίας και θειοφλαβίνη Τ

Abstract

This dissertation examines the nanotechnology methods and techniques for the study of the pathology and treatment of Alzheimer's Disease (AD), one of the most deadly neurodegenerative diseases of the 21st century. Aiming at the aggregation of beta-amyloid, a one of the two main hypotheses for the causes of the disease, the synthesis, activtion and characterization of superparamagnetic iron oxide nanocarriers (SPIONs) with silica coating and the presence of the Thioblavin T (ΤhT) dye was performed. The main goal was to create a multifunctional compound, which has the ability to bind to Aβ, dual imaging function (MRI and fluorescence), and potentially act as a therapeutic agent for the treatment of AD. To this end, and after extensive literature review and multiple experimental efforts, the divalent / trivalent Fe precipitation method was selected as the most representative technique for synthesizing SPIONs. Then, by additional tests, the parameters of the process that led to the synthesis of magemite (Fe3O4) with an average size of less than 15 nm were determined. Following, further literature investigation on a factor that carries not only the ability to bind to Aβ, but also additional properties that contribute to the imaging, diagnosis, and treatment of amyloid plaque formation, led to the ThT dye. ThT emits more strongly when it binds to Aβ, while in multiple studies it has been identified as an inhibitor in the appearance / development of the pathology under consideration. Combining the two requirements, and according to the experimental findings, as a second step in the process, a sol-gel method for SiO2 encapsulation was followed, creating a "core-shell" structure, with the simultaneous addition and inclusion of ThT. The overall process resulted in a nanocarrier with a superparamagnetic core, a bio-compatible SiO2 coating, and terminals with excellent average size of 20 nm. In each of the above stages, the chemical, structural, magnetic and optical properties of the product were examined and documented. T-SPIONs were tested with Aβ1-42, where successful binding and removal from solution was demonstrated. Different concentrations and mixing modes demonstrated a proportional correlation for the bindability to Aβ. However, saturation was observed above a concentration of T-SPIONs. The T-SPIONs toxicity to phagocytes was then examined. Experiments initially showed that the phagocytosis process is successful, with rates exceeding 60% even after 24 hrs. These results are supported by both flow cytometry and fluorescence testing. Subsequently, the non-toxicity of T-SPIONs was demonstrated by two colorimetric methods: a) cellular metabolic activity (MTT assay), and b) cell viability (Trypan Blue). Macrophage viability did not fall below 60% in the first 2 hrs, while it remained above 40% even after 48 hrs. In addition to toxicity, the balance between pro-oxidants and anti-oxidants was examined, and found to be unaffected even after 24 hrs. Finally, the reuse of T-SPIONs for the binding and degradation - by phagocytosis - of Aβ was successfully considered, providing promising results for a recyclable process of binding and "removal" of Aβ.

Στην παρούσα διδακτορική διατριβή εξετάστηκαν οι μέθοδοι και τεχνικές νανοτεχνολογίας για τη μελέτη της παθολογίας και αντιμετώπισης της Νόσου Alzheimer (NA), μίας εκ των πιο θανατηφόρων νευροεκφυλιστικών νόσων του 21ου αιώνα. Στοχεύοντας τη συσσωμάτωση του β-αμυλοειδούς, μία εκ των δύο βασικών υποθέσεων για τα αίτια της νόσου, πραγματοποιήθηκε η σύνθεση, ενεργοποίηση και χαρακτηρισμός υπερπαραμαγνητικών νανοφορέων οξειδίου του σιδήρου (SPIONs) με επικάλυψη πυριτίας και παρουσία της χρωστικής Θειοβλαβίνη T (ThT). Ο κύριος στόχος ήταν η δημιουργία ενός πολυ-λειτουργικού συμπλόκου, το οποίο έχει τη δυνατότητα πρόσδεσης στο Αβ, διττή απεικονιστική λειτουργία (MRI και φθορισμός), και εν δυνάμει δράση ως θεραπευτικός παράγοντας για την αντιμετώπιση της ΝΑ. Προς αυτή την κατεύθυνση, και ύστερα από εκτενή βιβλιογραφική επισκόπηση και πολλαπλές πειραματικές προσπάθειες, η μέθοδος της συγκαταβύθισης δισθενούς/τρισθενούς Fe επιλέχθηκε ως η πιο αντιπροσωπευτική τεχνική για τη σύνθεση SPIONs. Εν συνεχεία, μέσω επιπλέον δοκιμών προσδιορίστηκαν οι παράμετροι της διαδικασίας που οδήγησε στη σύνθεση μαγκεμίτη (Fe3O4) μέσου μεγέθους μικρότερου των 15 nm. Έπειτα, περαιτέρω διερεύνηση της βιβλιογραφίας για παράγοντα που να φέρει όχι μόνο τη δυνατότητα πρόσδεσης στο Αβ, αλλά και επιπλέον ιδιότητες που συνεισφέρουν στην απεικόνιση, διάγνωση, και αντιμετώπιση της δημιουργίας αμυλοειδικών πλακών, οδήγησαν στη χρωστική ΤhT. H ThT εκπέμπει πιο έντονα εφόσον προσδεθεί στο Αβ, ενώ σε πολλαπλές μελέτες έχει αναγνωριστεί και ως ανασταλτικός παράγοντας στην εμφάνιση/εξέλιξη της υπό εξέταση παθολογίας. Συνδυάζοντας τις δύο απαιτήσεις, και σύμφωνα με τα πειραματικά ευρήματα, ως δεύτερο στάδιο στη διαδικασία ακολουθήθηκε μία μέθοδο πηκτώματος για τον εγκλεισμό σε SiO2 δημιουργώντας μία δομή "core-shell", με αυτόχρονη προσθήκη και εγκλεισμό της ThT. Το αποτέλεσμα της συνολικής παρασκευαστικής διαδικασίας οδήγησε σε ένα νανοφορέα με υπερπαραμαγνητικό πυρήνα, βιο-συμβατή επικάλυψη SiO2, και ακροδέκτες με εξαιρετική δυνατότητα πρόσδεσης στο Αβ, με παράλληλη ικανότητα φθορισμού. Το τελικό προϊόν ονομάζεται Τ-SPION και έχει μέσο μέγεθος της τάξης των 20 nm. Σε κάθε ένα από τα παραπάνω στάδια, εξετάστηκαν και τεκμηριώθηκαν οι χημικές, δομικές, μαγνητικές και οπτικές ιδιότητες των προϊόντων. Τα T-SPIONs δοκιμάστηκαν με Aβ1-42, όπου αποδείχτηκε η επιτυχής σύνδεση και απομάκρυνση από διάλυμα. Διαφορετικές συγκεντρώσεις και τρόποι ανάμιξης απέδειξαν μία αναλογική συσχέτιση για την ικανότητα πρόσδεσης στο Aβ. Ωστόσο, παρατηρήθηκε κορεσμός αυτής πάνω από μία συγκέντρωση T-SPIONs. Εν συνεχεία εξετάστηκε η τοξικότητα των T-SPIONs σε φαγοκύτταρα. Τα πειράματα έδειξαν αρχικά ότι η διαδικασία της φαγοκυττάρωσης διενεργείται επιτυχώς, με ποσοστά που ξεπερνούν το 60% ακόμα και μετά από 24 hrs. Τα εν λόγω αποτελέσματα υποστηρίζονται τόσο με κυτταρομετρία ροής όσο και με εξέταση του φθορισμού. Εν συνεχεία, αποδείχθηκε η μη τοξικότητα των Τ-SPIONs με δύο χρωματομετρικές μεθόδους ανάλυσης της: α) κυτταρικής μεταβολικής δραστηριότητας (MTT assay), και β) βιωσιμότητας των κυττάρων (Trypan Blue). Η βιωσιμότητα των μακροφάγων δεν έπεσε κάτω από 60% στις πρώτες 2 hrs, ενώ παρέμεινε πάνω από 40% ακόμα και μετά από 48 hrs. Πλέον της τοξικότητας, εξετάστηκε και η ισορροπία μεταξύ προ-οξειδωτικών και αντι-οξειδωτικών, η οποία βρέθηκε ανεπηρέαστη ακόμα και μετά από 24 hrs. Τέλος, εξετάστηκε επιτυχώς η επαναχρησιμοποίηση των T-SPIONs για τη δέσμευση και αποδόμηση - μέσω φαγοκυττάρωσης - του Αβ, παρέχοντας υποσχόμενα αποτελέσματα για μια ανακυκλώσιμη διαδικασία δέσμευσης και "απομάκρυνσης" Αβ.