How does the spider mite Tetranychus urticae respond to bacteria infection

Abstract

As bactérias encontram-se distribuídas por todo o planeta, possuindo grande diversidade, o que lhes permite explorar uma vasta gama de habitats e recursos. Durante a vida de um animal, é provável que entre em contacto com estes microrganismos, algumas podendo penetrar as suas defesas, provocando infecção sistémica. Sabe-se que diferentes bactérias possuem diferente patogenicidade e que podem utilizar diferentes vias para infectar os seus hospedeiros. As vias mais comuns de infecção são a ingestão e a penetração por brechas nas barreiras protectoras dos organismos (por feridas, por exemplo). Sabe-se ainda que infecção por diferentes vias leva a diferentes respostas nos hospedeiros. Por exemplo, a infecção por via oral despoleta as defesas ao nível do intestino e do sistema imunitário; por seu turno, uma bactéria que penetre o organismo por uma ferida apenas activa o sistema imune. Contudo, independentemente da via, a infecção bacteriana exerce uma forte pressão selectiva nos hospedeiros, podendo levar à evolução de mecanismos de defesa contra bactérias. Para combater a infecção, o hospedeiro pode utilizar diferentes estratégias defensivas: 1) evitar ou diminuir o contacto com bactérias, 2) usar as barreiras físicas/químicas do seu corpo para impedir a penetração das bactérias, ou se as bactérias ultrapassarem as duas primeiras estratégias defensivas 3) activar o sistema imunitário, montando uma resposta contra a infecção. As defesas dos artrópodes contra bactérias têm sido estudadas, recorrendo a diversos organismos. A importância económica deste grupo na agricultura, o facto de terem impacto na saúde humana e as semelhanças que as defesas destes possuem com algumas das defesas dos vertebrados foram alguns dos motivos que levaram à realização destes estudos. Contudo, a maioria dos trabalhos tem-se focado em estudar Drosophila melanogaster, que observando a árvore filogenética dos artrópodes, surge como um dos representantes mais derivados, pertencendo à classe Insecta e ordem Diptera. Por ser um organismo tão derivado, as defesas de D. melanogaster possuem características que poderão não ser encontradas em organismos mais basais. O estudo de classes mais basais, como os Chelicerata, poderá inferir acerca das características mais ancestrais das defesas dos artrópodes face à infecção bacteriana. Como representante dos Chelicerata, neste trabalho foram estudadas as defesas do ácaro-aranha Tetranychus urticae. A análise do genoma de T. urticae revelou que este ácaro não possui inúmeros genes que em D. melanogaster são responsáveis pela resposta imunitária contra bactérias. As vias de genes Toll e IMD, responsáveis pela defesa contra bactérias Gram positivas e Gram negativas respectivamente, estão incompletas no ácaro. Para além disso, não foram encontradas AMPs, as proteínas efectoras das duas redes. Várias hipóteses, não exclusivas, foram propostas para explicar estes resultados: 1) T. urticae possui mecanismos/vias de genes diferentes de D. melanogaster; 2) no seu ambiente natural, a infecção bacteriana não é frequente e portanto não existe uma pressão selectiva selecionando imunidade contra bactérias; 3) os artrópodes mais basais não possuem sistema imune. A principal questão deste trabalho foi tentar identificar quais as estratégias defensivas que T. urticae usa para se proteger contra bactérias, de forma a poder validar algumas destas hipóteses. Para responder a estas questões, diferentes vias de infecção – ingestão, injecção e pulverização - foram testadas com o intuito de perceber se a via de infeção afecta a resposta do ácaro. Diferentes bactérias – Escherichia coli, Bacillus megaterium, Pseudomonas putida e Enterococcus faecalis - foram usadas para perceber se diferentes desafios levam a diferentes respostas. Usando microarrays, estudou-se a regulação da expressão génica após infecção por injecção; o que permitiu estudar se T. urticae possui um mecanismo de regulação da expressão génica diferente de Drosophila, ou se não possui nenhum mecanismo. Ainda, estudou-se se T. urticae comportamentalmente evita a ingestão de bactérias e se estímulos olfatórios despoletam esses comportamentos. Finalmente, recorrendo a outra espécie de ácaro (Sancassania berlesei) com uma ecologia diferente de T. urticae, inferiu-se se as características das defesas de T. urticae são representativas dos ácaros ou se são exclusivas ao ácaro-aranha. Primariamente, testou-se como a infecção por diferentes vias (ingestão, pulverização e injecção) afectava a sobrevivência de T. urticae. Para estudar o efeito de infecção por ingestão, por experiência 320 fêmeas adultas de T. urticae foram divididas por 4 tratamentos (alimentando-se de LB (controlo negativo) ou de bactérias à densidade óptica de 1, 10 ou 25) e colocados em arenas com bolhas de parafilm com o alimento contido no seu interior. O período de alimentação durava 48 horas e mais tarde, o número de ácaros vivos era contado, assim como o número de ácaros que ingeriram comida. Esta informação foi utlizada para estudar se T. urticae evitava ingerir alimentos contaminados com bactérias. Para além disso, os ácaros que ingeriram a comida contaminada, foram transferidos para folhas de feijão e a sua sobrevivência foi medida durante 4 dias. E. coli e a P. putida foram as bactérias testadas e para cada bactéria foram feitas 5 repetições da experiencia. Os resultados referentes à ingestão de alimentos contaminados, demonstraram que menos ácaros ingeriam comida contaminada com bactérias, que comida com LB. Esta observação verificou-se quer para E. coli , quer para P. putida. Em seguida analizou-se a sobrevivência dos ácaros que ingeriram a comida oferecida e observou-se que a sobrevivência dos ácaros era afectada, quer pela ingestão de E. coli, quer de P. putida. Considerando a infecção por pulverização, por experiencia, 200 ácaros foram colocados em caixas de petri com folhas de feijoeiro (um ácaro por folha), e foram pulverizados ou com LB ou com bactérias à densidade óptica de 1, 10 ou 25 (50 ácaros por tratamento). A sobrevivência dos ácaros após infecção foi medida durante 4 dias. As bactérias testadas foram E. coli, P. putida e E. faecalis. Para cada bactéria, foram feitas 3 repetições da experiencia. A pulverização de bactérias levou a uma grande redução da sobrevivência dos ácaros infectados, para todas as bactérias estudadas. Estes resultados sugerem que E. coli, P. putida e E. faecalis são bactérias patogénicas de T. urticae. Considerando as experiencias de injecção, por tratamento (LB, bactéria à densidade óptica de 0.1, 1 e 10 ) 100 ácaros foram injectados, transferidos para folhas de feijoeiro e a sua sobrevivência foi contada durante 48 horas. As bactérias testadas foram E. coli e B. megaterium. A infecção por injecção de bactérias levou a uma redução da sobrevivência dos ácaros infectados. A infecção com E. coli levou a uma redução da sobrevivência a valores próximos de 0% em apenas 48 horas. Considerando a experiencia com B. megaterium, houve igualmente uma redução da sobrevivência, observando-se diferenças consoante da concentração testada. Considerando as três vias de infecção testadas, a infecção por injecção levou a uma maior redução da sobrevivência de T. urticae. Após estudar o efeito da infecção por diferentes vias, o estudo da expressão génica de T. urticae após injecção foi testado usando microarrays. Analisou-se a expressão génica 3, 6 e 12 horas após injecção. As bactérias injectadas foram E. coli e B. megaterium à densidade óptica de 1, comparando-se os resultados com os de ácaros injectados com LB. Analizando os resultados dos microarrays, poucos genes sofreram alterações na sua expressão, para infecção quer com E. coli, quer para com B. megaterium. Não foi possível observar um padrão comum na função dos genes com diferente expressão e ainda, nenhum destes tem um papel conhecido na resposta imunitária, noutras espécies. Estes dados sugerem que T. urticae não possui uma resposta imune contra infecção, pelo menos contra E. coli e B. megaterium. Com o intuito de estudar o papel do olfacto no comportamento de evitamento de bactérias, recorreu-se a um olfactómetro conectado a uma bomba de vácuo. Estudou-se a influencia dos estímulos olfatórios no comportamento de evitamento de E. coli. Os ácaros testados na experiencia do olfactómetro não evitaram E. coli, sugerindo que os estímulos olfatórios não despoletam este comportamento. Visto que as defesas de T. urticae aparentam ser pouco eficazes, testou-se se estas seriam representativas dos artrópodes mais basais. Para tal, recorreu-se a outra espécie de ácaro, o Sancassania berlesei, e infectou-se esta espécie por pulverização e injecção de bactérias. A sobrevivência de S. berlesei não foi reduzida quando as bactérias foram pulverizadas sobre os ácaros e a injecção bacteriana apenas levou a uma redução da sobrevivência quando em concentrações elevadas. Em geral, os nossos resultados sugerem que T. urticae possui poucas defesas contra bactérias, recorrendo principalmente à capacidade de comportamentalmente evitar bactérias e de prevenir a penetração de bactérias graças às suas barreiras físicas/químicas. O habitat de T. urticae poderá explicar o porquê destas deficiências nas defesas, visto que as folhas, onde estes ácaros vivem e se alimentam, parecem possuir uma quantidade reduzida de bactérias, diminuindo a probabilidade de infecção. As experiencias com S. berlesei parecem apoiar esta conclusão de que a ecologia de T. urticae levou, durante a evolução da espécie, a uma degradação das defesas do ácaro-aranha. O facto dos afídios, que partilham o habitat de T. urticae, possuírem igualmente defesas fracas reforça a ideia de que a ecologia parece ter sido determinante. É ainda possível que T. urticae possua outras estratégias defensivas contra bactérias, como um aumento da oviposição após infecção, protecção conferida por endossimbiontes, ou ainda que a sua teia possua propriedades antimicrobianas.

Most organisms contact with bacteria during their lifetime, some of which cross the organism physical barriers, causing systemic infection. To prevent or cope with infection, hosts may use distinct strategies such as avoidance, physical or chemical barriers and deployment of immune defenses. We explored these different levels of defense in the spider mite Tetranychus urticae, with the aim to unveil basal features of arthropod immunity, from behavior to physiology and genetics. For this, we infected T. urticae with different bacteria, from different groups and with different degrees of pathogenicity to arthropods, under different infection routes: feeding, spraying and systemic injection. We also determined the impact of olfactory cues on avoidance behavior and the transcriptional response to infection by systemic infection using microarrays. We found that: i) all bacteria severely reduce the survival of spider mites under all routes of infection ii) avoidance to bacteria is observed, although odor cues do not appear to play a role, iii) no consistent upregulation or downregulation of genes is observed under any of the infection scenarios. Comparison between T. urticae and other mite species with a different ecology, Sancassania berlesei, suggests that T. urticae defenses may not represent mites’ defenses, neither basal arthropods’. S. berlesei mites were not as susceptible to bacteria infection as T. urticae, when infected by spraying and systemic infection. Overall, the results from the different infection regimes and microarrays suggest that, independently of the route and bacteria tested, spider mites are unable to respond to infection. T. urticae defenses against bacterial infection rely on avoidance behavior and its body phisycal/chemical barriers and we hypothesize that other factors (eg web), may also confer protection.