Diagnóstico molecular de doentes com Hipercolesterolemia Familiar: estudo do efeito das mutações de splicing no LDLR

Abstract

Familial Hypercholesterolemia (FH) is an autosomal dominant disease, characterized by high levels of plasma cholesterol, which results in the premature development of atherosclerosis and coronary heart disease. FH is caused mainly by mutations in the gene that codifies for the low density lipoproteins receptor (LDLR); however patients with mutations in apolipoprotein B (APOB) and proprotein convertase subtilisin/kexin type 9 (PCSK9) genes present a similar phenotype to the ones with mutations in LDLR. These three genes have been studied in the Portuguese Familial Hypercholesterolemia Study (EPHF). The objective of this project was to evaluate the effect of thirteen splicing mutations on the RNA, found in this study, and correlate the patient.s phenotype with his genotype, taking into account the severity of the mutation found. Patients with these splicing mutations were recruited for a new blood collection, needed in order to extract their RNA. Once extracted, the RNA was analysed by Reverse Transcriptase PCR and sequencing analysis. Regarding the seven mutations that were studied, only four are responsible for the incorrect splicing in the patients that carry them. Of these mutations, only one leads to the total retention of an intron, whereas the other three originated the total skipping of an exon, this being the most common effect. It wasn.t possible to analyse the other six mutations in study due to lack of sample. Because we developed a quick and reliable method to study splicing mutations, this work has contributed to confirm that, instead of what is presented in most studies, it is not enough to identify these mutations, but RNA studies are essential in order to confirm if this alterations do really affect splicing, because as we saw on this work, not all mutations in splice sites affect the correct splicing of LDLR

A Hipercolesterolemia Familiar (FH) é uma doença autossómica dominante, caracterizada por níveis elevados de colesterol plasmático, o que origina o desenvolvimento precoce da aterosclerose e doença coronária. É causada maioritariamente por mutações no gene que codifica para o receptor das lipoproteínas de baixa densidade (LDLR); contudo, doentes com mutações nos genes da apolipoproteína B (APOB) ou da proprotein convertase subtilisin/kexin type 9 (PCSK9) apresentam um fenótipo semelhante ao dos doentes com mutações no LDLR. Estes três genes têm sido estudados no âmbito do Estudo Português de Hipercolesterolemia Familiar (EPHF). O objectivo deste trabalho foi avaliar o efeito no RNA das treze mutações de splicing encontradas no decorrer deste estudo em dezassete casos-índex e co-relacionar o fenótipo do doente com o genótipo obtido, tendo em conta a gravidade da mutação estudada. Os doentes nos quais foi descoberta uma mutação de splicing foram recrutados para nova colheita de sangue para a extracção de RNA. Uma vez extraído, este foi analisado por Reverse Transcriptase PCR e sequenciação. Das sete mutações estudadas, apenas quatro são responsáveis pelo incorrecto splicing do LDLR nos indivíduos que as apresentam. Destas mutações, apenas uma levou a retenção total de um intrão, enquanto que as outras três originaram o skipping total de um exão, sendo este o efeito mais comum. Não foi possível analisar as outras seis mutações em estudo devido a ausência de amostra. Ao desenvolver um método rápido e fiável para o estudo de mutações de splicing, este trabalho contribuiu para confirmar que, ao contrário do que é apresentado na maioria dos estudos, não basta identificar estas mutações, mas sim deve-se efectuar estudos ao nível do RNA, de forma a confirmar se estas alterações afectam realmente o splicing ou não, pois como podemos observar neste trabalho, nem todas as mutações em splice sites afectam o c