The role of alpha-synuclein phosphorylation in synucleinopathies

Abstract

Alpha-synuclein (aSyn) is a pre-synaptic protein linked to Parkinson’s disease (PD) both by genetic and pathological evidence. The gene encoding for aSyn was the first to be associated with familial forms of PD. In concert, aSyn was identified as the main component of Lewy Bodies (LBs), one of the pathological hallmarks of PD along with the loss of dopaminergic neurons from the substantia nigra. The discovery that the same protein –aSyn- and its aggregation propensity were involved in the pathogenesis of both sporadic and genetic PD cases propelled the aSyn research field. Remarkably, further findings characterize a range of diseases with parkinsonian features and presenting aSyn aggregates, the so-called synucleinopathies. These include amongst others PD, Parkinsons’s disease with dementia, dementia with Lewy Bodies (LBs), and Multiple System Athrophy (MSA). Nonetheless, the exact mechanisms responsible for aSyn aggregation and toxicity still remain unknown. Try to understand the molecular pathways behind aSyn misfolding properties is crucial to shed light into the neurodegeneration process, and in the search for therapeutic treatments that may alleviate the social burden of PD and related diseases. This thesis focuses on the study of the role of aSyn phosphorylation, a post-translational modification (PTM) that was shown to be essential in modulating aSyn function, aggregation and toxicity. aSyn is indeed phosphorylated on serine 129 (Ser-129) in physiological conditions, phosphorylation that goes awry during the pathogenesis of the disease resulting in 90% of aSyn phosphorylated in the LBs of brain from patients and transgenic animals models of PD. The importance of this modification became soon specific since antibodies used against this residue were adopted as common staining procedure for LBs structures. Recently, other phosphorylation sites have received intense attention; in particular tyrosine 125 (Tyr-125) phosphorylation levels were shown to be significantly reduced in diseased brains. Despite the great effort to discover the kinases mediating aSyn phosphorylation; the contribution of this modification to aSyn toxicity and aggregation remains elusive. This is primarily due to the usage of several different methodological approaches, the difficulty to study in vivo such a rapid and reversible modification and the absence of phosphorylation mutants’ forms that can properly mimic the effect of this PTM. For these reasons, the purpose of this thesis was to investigate the pathways involved in aSyn phosphorylation using a simple, effective and well-established model for neurodegenerative diseases: the yeast Saccharomyces cerevisiae. This model has been extensively used to identify several pathways involved in PD and to generate a consistent model for aSyn aggregation that mimics the disease one. Therefore, we took advantage of the power of yeast to investigate the effects of aSyn phosphorylation on Ser-129 co-expressing human aSyn and known kinases able to phosphorylate it; namely the Polo-like kinases family (PLKs). We studied aSyn inclusions formation and toxicity and we then proceeded to validate the results in established mammalian cell model of PD. Our approach demonstrated a unique role for one of the member of the kinases family -PLK2- in aSyn inclusion formation. We showed that PLK2 expression and aSyn phosphorylation on Ser-129 are both required for aSyn inclusion formation. The role of aSyn Tyr-125 phosphorylation was then studied in an established oligodendroglial model of MSA. We demonstrated that this modification can prevent aSyn aggregation propensity, but only when phosphorylation on Ser-129 occurred. We then identified novel tyrosine kinases inhibitors that may be involved in the disease, but further experimental data will elucidate these potential targets. Furthermore, using yeast we implemented a functional screening and characterized novel kinases, but most importantly, new pathways involved in aSyn pathobiology. ATG1, a kinase involved in autophagy, represented one of the major modulator of aSyn aggregation and toxicity in yeast; however this novel player requires further validation in mammalian systems to establish its potential for therapeutic purposes. Altogether, these results provide novel insights and implications for the function of aSyn phosphorylation in PD: a co-operative role for serine and tyrosine residue embodies a novel clue to unravel aSyn misfolding behavior. Our data represent a unique opportunity to tackle one side of aSyn phosphorylation function ad further validate the importance of this PTM in aSyn pathobiology.

A alfa-sinucleina (aSyn) é uma proteína sináptica que está associada à doença de Parkinson (DP) segundo evidências genéticas e patológicas. O gene da aSyn foi o primeiro a ser associado a casos familiares de DP e a proteína que é codificada foi a primeira a ser identificada e como maioritariamente presente nos corpos de Lewy (CL), uma das características patológicas da doença. A descoberta de que a aSyn e a sua propensão para agregar estão envolvidas não só na patogénese dos casos esporádicos como dos casos genéticos estimulou a investigação nesta área. Estudos posteriores identificaram uma série de doenças que apresentam várias características parkinsónicas, incluindo a presença de agregados de aSyn, e que por isso foram designadas sinucleinopatias. Neste grupo de doenças inclui-se a doença de Parkinson com demência, demência com Corpos de Lewy e Atrofia de Múltiplos Sistemas (AMS). No entanto, os mecanismos específicos responsáveis pela agregação e toxicidade da aSyn ainda estão por desvendar. É crucial entender as vias moleculares responsáveis que levam à perda de conformação da aSyn para aprofundar o conhecimento sobre o processo de neurodegeneração e encontrar novas terapias que possam atenuar o peso soció-económico da DP e doenças relacionadas. Esta tese foca-se no estudo do papel da fosforilação da aSyn, uma modificação pós-traducional essencial na modulação da função da aSyn, na sua agregação e toxicidade. Em condições fisiológicas apenas 4% da aSyn é fosforilada na serina 129 (Ser-129), enquanto que na DP 90% da aSyn está fosforilada e deposita-se nos CL dos cérebros dos doentes, um mecanismo reprodutível em modelos de animais transgénicos da DP. A importância desta modificação tornou-se específica dado que têm sido usados como procedimento comum anticorpos contra este resíduo para corar os CL. Recentemente, outros locais de fosforilação têm sido alvo de estudo, em particular a tirosina 125 (Tir-125), cujos níveis de fosforilação estão particularmente reduzidos nos cérebros de doentes. Apesar do grande esforço para descobrir as cinases que fosforilam a aSyn, a contribuição desta modificação para a sua agregação e toxicidade é ainda desconhecida por várias razões: a utilização de métodos experimentais diferentes, o facto de ser uma modificação difícil de estudar in vivo dada a rapidez e reversibilidade da fosforilação, e porque não existem mutantes que consigam mimetizar convenientemente o efeito desta modificação. Por estas razões, o objectivo desta tese é estudar as potenciais vias envolvidas na fosforilação da aSyn, usando um modelo simples, eficaz e bem estabelecido para doenças neurodegenerativas: a levedura Saccharomyces cerevisiae. Este modelo tem sido usado com sucesso na identificação de várias vias envolvidas na DP, tais como a disfunção mitocondrial e do proteassoma e, surpreendentemente a formação de inclusões de aSyn que mimetizam as inclusões observadas na doença. Tirando partido deste modelo caracterizámos o efeito de cinases conhecidas na fosforilação da Ser-129, nomeadamente da família das cinases tipo-Polo. Caracterizámos a formação de inclusões de aSyn e a sua toxicidade em levedura, e posteriormente validámos os resultados em modelos celulares de mamíferos de DP. Demonstrámos um papel único da PLK2, um dos membros da família das cinases tipo Polo, quanto à formação de inclusões de aSyn. Verificámos que a expressão de PLK2 e a fosforilação de aSyn são necessários para a formação de inclusões de aSyn. O papel da fosforilação da Tir-125 foi estudado num modelo celular já estabelecido de AMS em oligodendrócitos. Nós demonstrámos que esta modificação pode prevenir a propensão da aSyn para agregar, mas apenas quando a fosforilação na Ser-129 ocorre simultaneamente. Posteriormente identificámos novos inibidores de cinases de tirosinas que podem estar envolvidas na doença, mas mais estudos são necessários para identificar estes potenciais alvos. Além disso, implementámos um screening funcional nas leveduras e caracterizámos novas cinases e novas vias envolvidas na patobiologia da aSyn. A cinase com maior efeito na modulação da agregação e toxicidade da aSyn foi a Atg1 que está envolvida na autofagia. É necessário validar o papel desta cinase em sistemas de mamíferos para estabelecer o seu potencial terapêutico. Em resumo, estes resultados proporcionam novos conhecimentos e implicações para a função da fosforilação da aSyn na DP: um papel conjunto da fosforilação na serina e tirosina que aponta uma nova pista para desvendar a perda de conformação da aSyn. Os nossos resultados representam uma oportunidade única para estudar a função da fosforilação e por outro lado validar a importância desta modificação pos-traducional na patobiologia da aSyn.