Utilize este identificador para referenciar este registo:
http://hdl.handle.net/10451/2340
Título: | Strategies for T-cell reconstruction : insights from human clinical models |
Autor: | Albuquerque, Adriana Silva de, 1976- |
Orientador: | Sousa, Ana Espada de, 1962- |
Palavras-chave: | Linfócitos T Timo Síndrome de imunodeficiência adquirida HIV Doença granulomatosa crónica Factor 3-alfa nuclear de hepatócito Teses de doutoramento - 2010 |
Data de Defesa: | 2010 |
Resumo: | The thymus is essential for both the establishment of the peripheral T cell pool and
the generation of the diverse T cell receptor (TCR) repertoire capable of dealing with
new pathogens and controlling the escape of persistent infections. In humans, the
thymus is almost fully developed at birth, with the rate of T cell production markedly
decreasing after puberty. However, it is now clear that this central lymphoid organ
plays an essential role in the lifetime “de novo” generation of T cells. The maintenance
of naïve T cells is currently thought to depend upon a combination of peripheral T cell
proliferation as well as to an age-dependent contribution of recent thymic emigrants. The overall aim of this work was to investigate the relative roles of the thymus and
the “periphery” in the maintenance/recovery of the human T cell compartment
through the study of specific clinical models.
FOXN1 is a transcription factor, expressed by thymic epithelium, crucial for both
the development of the thymus and prevention of its involution. Defects in FOXN1 in
mice lead to athymia in association with total alopecia, due to its additional role in hair
follicle differentiation (“nude-SCID mice”). Human FOXN1 deficiency was first
reported by Pignata et al. in two sisters from Italy that, despite the evidence of athymia,
exhibited a significant number of circulating T cells. We identified the same
homozygous R255X mutation in a Portuguese child, who presented at 5 months of age
with alopecia, respiratory failure due to Bacillus Calmette-Guérin (BCG) dissemination
following routine neonatal BCG vaccination, and circulating T cells of non-maternal origin at close to normal numbers. The first aim of this work was to investigate the T
cell population generated in the presence of FOXN1 deficiency.
Circulating T cells were equally distributed between CD4, CD8 and, strikingly, an
abnormally increased population of TCR αβ+ cells that expressed neither CD4 nor CD8
(double-negative, DNαβ), which usually represent less than 1% of the peripheral T cell
pool. T cells were non-naïve, oligoclonal, activated, and unable to proliferate in vitro.
The thymus is known to produce a regulatory CD4 T cell subset (Treg), with
suppressive properties, fundamental for preventing autoimmunity. Currently they are
best identified by expression of the forkhead box P3 transcription factor FoxP3.
Notably, more than 40% of the CD4 subset expressed high levels of FoxP3 and had a
clear regulatory-like T cell (Treg) phenotype. Thus, human FOXN1-deficiency due to
R255X mutation was associated with significant numbers of oligoclonal T cells
suggesting that, to a certain extent, T cell development still occured, albeit with altered
positive/negative selection, as illustrated by the aberrant expansion of FoxP3+ and DN
subsets.
As FOXN1 mutations impact on thymic epithelium rather than hematopoietic
precursors, we predicted that thymic transplantation, although never performed before
in this setting, could be a curative strategy. This was confirmed by the documentation
of the clinical efficacy of HLA-mismatched thymic transplantation, as attested by the
temporal association between the clearance of the ongoing BCG adenitis and the
development of specific responses against mycobacterium antigens. Our study of the kinetics of establishment of the T cell pool after HLA mismatched
thymic transplantation provides unique data regarding the dynamics of replenishment
of the immune system.
A progressive increase of naive (antigen non-experienced cells) T cells was also
observed, resulting in the generation of a fully diverse CD4 T cell repertoire in spite of
the HLA-mismatched thymic epithelia.
Reconstitution of the Treg pool occurred in parallel to that of the CD4 subset,
leading to stable frequencies within the normal range. Thymic Treg development is
currently thought to be dependent upon a small developmental niche that tightly
controls Treg output. It is thus possible that FOXN1 plays a role in such niches,
contributing to the thymic regulation of Treg numbers.
In contrast, a significant population of circulating DNαβ persisted, at relatively
stable frequencies (17% of αβ T cells) and phenotype, throughout 5yrs of follow-up.
Although the possibility that DNαβ T cells are long-lived cells generated pretransplant
cannot be excluded, it is also plausible that their persistence may reflect a
continuous production of this population by a putative thymic rudiment.
The functionality of the allogeneic thymic graft was further estimated by sj/βTREC
quantification; a ratio between early and late products of TCR rearrangements that was
shown to represent an indirect measurement of thymocyte division-rate, and a direct
correlate of thymic output. A progressive increase of the sj/βTREC ratio was observed,
reaching levels comparable to those found in healthy children. Importantly, a sharp
decline of sj/βTREC, accompanied by a decrease in the proportion of naïve cells was
observed 4yrs post-transplant. Notably, these values plateaued thereafter, suggesting
that steady-state equilibrium could be established after replenishment of the immune system. Importantly, our data showed that immunocompetence can be achieved through
HLA-mismatched thymic transplantation, despite the lack of a sustained thymocytedivision
rate (as evidenced by sj/βTREC). These novel data regarding the long-term
sustainability of allogeneic thymic tissue and the immunological reconstitution
achieved have implications for the design of immune-based therapeutic strategies to be
used in other clinical settings.
Recent studies suggested the possibility of a thymic rebound as a compensatory
feedback loop triggered by emptiness of the peripheral T cell pool, particularly in HIV
infection. The cytokine IL-7 has been highlighted as a possible factor in this process. IL-
7 has also a central role in peripheral T cell homeostasis. The IL-7 driven peripheral T
cell proliferation/survival is thought to be able to compensate any putative thymic
impairment resulting either directly from HIV infection, or from the heightened state
of immune-activation that characterizes HIV disease. In fact, the persistent immune
stimulation, and the consequent T cell anergy and susceptibility to apoptosis, are
considered key determinants of CD4 decline and AIDS progression.
The second specific aim of this work was to investigate the interplay of these
pathways during HIV/AIDS. The originality of this study mainly resulted from the
definition of the cohorts under investigation. HIV-1+ patients with discordant
responses to ART (ART-Discordants, poor CD4 recovery despite suppression of
viremia) were compared with HIV-2+ patients that exhibited a similar degree of CD4-
depletion and reduced circulating virus in the absence of ART. Untreated HIV-1+ patients who are expected to have high viremia, as well as HIV-1+ patients under ART
with successful virological and immunological responses were studied in parallel.
Low CD4-counts were associated with major naïve CD4 and CD8 depletion,
irrespective of type of infection or ART-exposure. Several pathways were likely to
contribute to the CD4-count stability and low rate of opportunistic infections
documented in ART-Discordants in spite of their presumed thymic impairment,
namely lower levels of T cell activation and a better ability to use IL-7 as indicated by
the expression levels of the IL-7 induced, anti-apoptotic molecule, Bcl-2.
Our third specific aim was based on the study of an individual with chronic
granulomatous disease (CGD), a primary defect in the phagocytic oxidative burst,
who, despite being HIV negative, presented CD4 T cell depletion at levels similar to
those found in advanced AIDS patients. CGD represents the most prevalent (1:200000
live births) primary phagocytic defect. This 32-year-old patient, presenting with typical
CGD-associated infections, had a CD4 lymphopenia of less than 200 cells/l, for more
than 16 years. Although there are previous reports of diminished T cell numbers in
CGD patients, these studies did not include phenotypic and functional T cell analysis.
We found a generalized immune activation, in conjunction with markers of increased
cell-turnover, including a reduced telomere length of both the CD4 and CD8 subsets,
and expansion of terminally-differentiated effector CD8 T cells. Additionally a marked
loss of naïve T cells was found, with evidence of impaired thymic production as
assessed by sj/βTREC ratio, despite the increased IL-7 levels. This immunological
profile has been considered a risk for infections, and was shown to be an independent
predictor of death in aged subjects. Therefore, it is worth considering this putative
exhaustion of immune resources in the evaluation of long-term therapeutic strategies, including stem-cell transplantation, given the increasing life-expectancy of CGD
patients.
Overall, our data provide evidence that, although immunodeficiency may be
associated with profound lymphocyte disturbances, different pathways can be
exploited to achieve immunological competence. The characterization of these
pathways in human models is of importance for the definition and design of new
strategies for immune reconstitution. O timo é o orgão linfóide primário que tem por função a produção de células T. A actividade tímica decresce progressivamente com a idade, mas, apesar de ocorrer uma clara involução do timo na puberdade, está claramente demonstrada a produção “de novo” de células T até depois dos 60 anos. Esta é considerada essencial para assegurar um repertório do receptor de células T (TCR) suficientemente diverso para responder a qualquer novo agente patogénico e capaz de prevenir a emergência de estirpes resistentes em infecções crónicas como a infecção HIV/SIDA. O compartimento periférico de células T é assim mantido não só pela proliferação linfocitária nos órgãos linfoides secundários mas também pela entrada contínua de novas células produzidas no timo. Este trabalho tem por objectivo investigar o contributo relativo do timo e da periferia para a homeostasia e reconstituição do compartimento de células T através do estudo de imunodeficiências. O FOXN1 é um factor de transcrição expresso pelo epitélio do timo essencial para o seu desenvolvimento e também recentemente implicado na prevenção da involução tímica. Mutações no gene FOXN1 no ratinho associam-se a ausência de timo e a alopécia total, devido ao papel adicional deste na diferenciação dos folículos pilosos (“nude-SCID mice”). Os primeiros casos de mutação do FOXN1 foram descritos por Pignata et al em duas irmãs da Sicília que apesar da evidência de atímia, apresentavam um número significativo de células T circulantes. Identificámos a mesma mutação homozigótica R255X numa criança Portuguesa com alopécia total a quem foi diagnosticada, aos 5 meses de idade, disseminação do Bacillus Calmette-Guérin (BCG) após vacinação perinatal de rotina com BCG. Nesta altura, apresentava um número de células T circulantes próximo do normal que não tinham origem materna. Assim, o primeiro objectivo do trabalho consistiu no estudo da população de células T gerada na presença de deficiência de FOXN1. As células T circulantes distribuíam-se igualmente entre as subpopulações CD4, CD8 e, aberrantemente, a subpopulação T de células com TCR αβ que não exprimem nem CD4 nem CD8 (duplas-negativas, DNαβ), que são geralmente inferiores a 1%. As células T apresentavam marcadores de memória e activação; eram oligoclonais e não proliferavam após estimulação in vitro. O timo produz também uma população de células T reguladoras (Treg) que representam cerca de 5% da subpopulação CD4, com propriedades supressoras, fundamental para a prevenção de autoimunidade, identificadas pela expressão do factor de transcrição “forkhead box P3” (FoxP3). No presente caso, mais de 40% das células CD4 circulantes expressavam altos níveis de FoxP3 e um fenótipo claramente supressor. Assim, a deficiência de FOXN1 devida à mutação R255X associa-se à presença de células T oligoclonais sugerindo a existência de manutenção de desenvolvimento de linfócitos T, embora com alterações da selecção positiva/negativa ilustrada pela expansão aberrante de células FoxP3+ e DNαβ. Uma vez que o defeito se restringia ao epitélio tímico, era plausível que o transplante tímico pudesse ser uma estratégia curativa apesar de ser actualmente uma terapia experimental nunca anteriormente usada neste contexto. Observou-se uma progressiva recuperação imunológica após o transplante tímico realizado aos 14 meses de idade, ilustrada pela associação temporal entre a documentação de respostas T específicas ao BCG e a resolução da adenite persistente. O estudo da cinética de estabelecimento do compartimento de células T após transplante de timo com um grau elevado de incompatibilidade HLA representa um contributo único para a compreensão da dinâmica de reconstituição do sistema imunitário. Observou-se uma reconstituição progressiva das células T naïve exibindo uma diversidade do repertório conservada apesar da incompatibilidade HLA do epitélio tímico. O estabelecimento da população Treg teve uma cinética semelhante às células CD4 mantendo níveis normais. Dados recentes sugerem que o desenvolvimento da população Treg no timo está dependente de um pequeno “nicho” que controla o número de células produzidas. É plausível especular que o FOXN1 desempenhe um papel nestes “nichos” e contribua para a regulação do número de Treg. Em contraste, observou-se a persistência da população DNαβ ao longo dos 5 anos de seguimento, sugerindo uma produção mantida eventualmente num possível rudimento tímico associado à mutação FOXN1. A função do enxerto tímico alogénico foi ainda estimada pela quantificação do sj/βTREC, um rácio entre produtos precoces e tardios do rearranjo do TCR no timo, que representa uma medida indirecta do número de divisões intra-tímicas e que se correlaciona directamente com a produção tímica. O rácio sj/βTREC atingiu níveis comparáveis aos observados em crianças saudáveis. No entanto, 4 anos póstransplante, documentou-se um declínio marcado do rácio sj/βTREC suportando uma diminuição da actividade do enxerto. Apesar disso, observou-se apenas uma pequena redução seguida de estabilização das células T naive, sugerindo que após reconstituição do sistema imunitário a homeostasia periférica consegue assegurar a manutenção da população T naive. Assim, os nosso dados demonstram que é possível adquirir competência imunológica com transplante tímico independentemente da compatibilidade HLA, mesmo na ausência de sustentabilidade do enxerto sugerida pela diminuição do rácio sj/βTREC, o que tem implicações para o desenvolvimento de novas estratégias de reconstituição imunológica noutros contextos clínicos. Estudos recentes sugerem um aumento compensatório da actividade tímica em resposta a uma diminuição do compartimento de linfócitos T. Tem sido atribuído um papel à citocina IL-7 neste processo para além dos seus efeitos na proliferação homeostática das células T na periferia. A infecção pelo HIV está associada a uma perda progressiva de células T CD4, sendo ainda controversa a capacidade do timo de compensar esta perda bem como de promover a reconstituição desta população após terapêutica antiretroviral (ART) em doentes infectados pelo HIV-1. Por outro lado, os efeitos periféricos da IL-7 podem minimizar a possível redução da actividade tímica quer devida à infecção directa dos timócitos pelo HIV quer mediada pela hiperactivação generalizada associada à infecção. De facto, a activação persistente do sistema imunitário, com a consequente anergia e aumento da susceptibilidade à apoptose, é considerada determinante na progressão para SIDA. O segundo objectivo deste trabalho foi investigar a relação destas vias na infecção HIV/SIDA. A originalidade deste estudo residiu na comparação de doentes infectados pelo HIV-2, que mesmo na ausência de terapêutica antiretroviral têm virémia reduzida, com indivíduos infectados pelo HIV-1 com supressão terapêutica da virémia e diferentes graus de recuperação das células T CD4. A comparação com doentes infectados pelo HIV-1 não tratados e, portanto, com elevada virémia, permitiu concluir que a linfopénia CD4 se associa a uma perda de células T naive, quer CD4 quer CD8, independentemente do tipo de infecção ou exposição à ART. Nos doentes HIV-1+ tratados com ausência de recuperação das contagens CD4 apesar de resposta virológica, várias estratégias parecem contribuir para suster o declínio das células T CD4 e proteger de infecções oportunistas, nomeadamente: menores níveis de activação imunológica e uma melhor utilização da IL-7 atestada pelo aumento dos níveis intracelulares de Bcl-2, uma molécula anti-apoptótica induzida pela IL-7. O terceiro objectivo deste trabalho baseou-se no estudo de um doente com Doença Granulomatosa Crónica (CGD) e uma linfopénia CD4 persistente na ausência de infecção pelo HIV. A CGD constitui a deficiência fagocitária primária mais frequente (1:200000 nascimentos) e é causada por defeitos na capacidade oxidativa fagocitária. Este doente de 32 anos, com uma clínica de infecções tipicamente associadas à CGD, apresentou contagens de células T CD4 inferiores 200 células/l durante mais de 16 anos. O estudo efectuado revelou uma activação linfocitária generalizada, com diferenciação efectora terminal dos linfócitos T CD8 e uma redução da dimensão dos telómeros das subpopulações T, sugerindo um turnover celular aumentado devido a uma estimulação persistente do sistema imunitário. Além disso, observou-se uma depleção marcada das células T naive, com evidência de diminuição da timopoeise estimada pelo rácio sj/βTREC, apesar dos níveis elevados de IL-7 sérica. Este perfil imunológico tem sido associado a um risco elevado de infecções e sido considerado um factor preditivo de morte em indivíduos com idade avançada. O aparente esgotamento dos recursos imunológicos é particularmente relevante tendo em conta o aumento de esperança de vida dos doentes com CGD, devendo ser considerado na definição de indicações terapêuticas, incluindo transplante de células hematopoiéticas. Em conclusão, este trabalho demonstra que diferentes vias podem ser exploradas para atingir competência imunológica mesmo na presença de profundas alterações linfocitárias. O seu estudo baseado em modelos humanos é fundamental para o desenvolvimento de novas estratégias de reconstituição imunológica. |
Descrição: | Tese de doutoramento, Ciências Biomédicas (Ciências Biopatológicas), Universidade de Lisboa, Faculdade de Medicina, 2010 |
URI: | http://hdl.handle.net/10451/2340 |
Aparece nas colecções: | FC - Teses de Doutoramento |
Ficheiros deste registo:
Ficheiro | Descrição | Tamanho | Formato | |
---|---|---|---|---|
ulsd059371_td_Adriana_Albuquerque.pdf | 3,43 MB | Adobe PDF | Ver/Abrir |
Todos os registos no repositório estão protegidos por leis de copyright, com todos os direitos reservados.