Optogenetic investigation of striatal cell type during timing behavior

Abstract

Para conseguirem sobreviver num ambiente em constante mudança, é essencial que os animais consigam prever o desfecho de um determinado evento e/ou desenvolver comportamentos antecipadamente, no caso de esse mesmo evento voltar a acontecer. A cronometragem é um dos processos implicados nestes e noutros contextos de aprendizagem, já que confere ao organismo a capacidade de medir a duração do tempo entre eventos numa escala de segundos a minutos a horas. Embora muitos modelos teóricos tenham sido desenvolvidos na tentativa de explicar a forma como o nosso cérebro codifica informação temporal, poucos são aqueles que tentam explicar a forma como os estímulos exteriores são integrados, o papel de diferentes tipos celulares nessa integração e ainda a influência do estado das redes neuronais no momento de integração. Apesar da sua extrema importância, o nosso conhecimento sobre como o cérebro representa a passagem do tempo é ainda muito limitado, parcialmente devido à falta de paradigmas comportamentais que acomodem electrofisiologia e também devido à incapacidade de identificar tipos neuronais específicos recorrendo a técnicas clássicas de electrofisiolofia extra-celular. Em relação à cronometragem, diversos estudos indicam que os gânglios da base desempenham um papel fundamental no processamento de informação temporal. Anomalias no circuito dos gânglios da base estão intimamente ligados a doenças severas como a doença de Parkinson, doença de Huntington ou esquizofrenia, cujos pacientes demonstram incapacidades não só a nível motor, mas também na performance de tarefas de cronometragem. No entanto, as áreas envolvidas nestes processos, como é o caso do corpo estriado, possuem uma grande heterogeneidade a nível neuronal, tornando ainda mais complexo o estudo do papel de cada tipo de neurónio na representação temporal. Existem pelo menos dois tipos de neurónios de projecção (MSNs) e quatro tipos de interneurónios no corpo estriado, e cada um deste tipo de células poderá desempenhar papeis distintos durante o processamento de informação temporal. Sabe-se que cada tipo de MSNs expressam predominantemente receptores para a dopamina do tipo 1 (D1) ou do tipo 2 (D2), formando subpopulaçoes de neurónios D1MSN ou D2MSN distribuídas no estriado. Sabe-se que os receptores D1 e D2 produzem efeitos antagónicos em cascadas intra-celulares, quando ligados à dopamina. Existem ainda estudos que sugerem um papel importante do receptor D2 na capacidade de estimar intervalos de tempo. O desenvolvimento de linhas de ratinhos transgénicas torna a utilização deste modelo animal muito apelativa neste prisma, já que pode facilitar o desenvolvimento de técnicas para identificação in vivo destes diferentes tipos de neurónios. No entanto, a real aplicabilidade destes animais a paradigmas comportamentais dinâmicos e complexos é questionada. Pretende-se com este trabalho treinar ratinhos numa tarefa de cronometragem que acomode electrofisiologia, mas que seja mais dinâmica do que as tarefas clássicas utilizadas nesta área actualmente. Paralelamente, esperamos conseguir isolar diferentes tipos neuronais no corpo estriado de forma a que, a longo prazo, seja possível distinguir o tipo de célula cuja informação está a ser gravada durante experiências de electrofisiologia. Treinámos ratinhos numa nova tarefa de cronometragem altamente dinâmica chamada Serial Fixed Interval (SFI). Esta tarefa foi desenvolvida no nosso laboratório, baseada num paradigma clássico no estudo de cronometragem, denominado Fixed Interval (FI) schedule. O equipamento da tarefa SFI é bastante simples, consistindo apenas numa alavanca de metal e um orifício por onde a recompensa (uma gota de água com açúcar) é entregue. Durante o período de treino e teste na tarefa SFI, os ratinhos são privados de água e estimam diferentes intervalos de tempo, tendo apenas a última recompensa como referência para estimarem a entrega da próxima recompensa. Após a entrega de uma recompensa, os ratinhos passam um determinado intervalo fixo (FI) de tempo sem terem a possibilidade de receber qualquer gota de água com açúcar, mesmo que pressionem a alavanca de metal. Após este intervalo fixo terminar, os animais têm 15 segundos durante os quais a primeira resposta na alavanca produz uma recompensa e o FI de espera repete-se. Após pelo menos 25 repetições do mesmo FI, que representa um bloco de tentativas, selecciona-se aleatoriamente uma nova duração, e durante uma sessão de duas horas são estimados vários blocos com intervalos de tempo diferentes. Durante o decorrer da tarefa, os ratinhos desenvolveram um padrão de resposta que indica que estes animais estão a estimar intervalos de tempo. Depois de receberem uma recompensa, os ratinhos esperam um determinado intervalo de tempo antes de voltarem a pressionar a alavanca para tentar receber uma nova recompensa, e a esta latência para responder novamente chamamos PRP. Este padrão de respostas dos ratinhos é sensível à passagem do tempo, já que observamos que os PRPs variam no mesmo sentido da variação do FI entre cada bloco. Mais especificamente, obtivemos correlações significativas entre as PRPs e o intervalo anterior experimentado pelo animal, quer em sessões individuais (R2 = 0.45809, valor P < 0.001) quer na análise de toda a população (R2 = 0.7813, valor P < 0.001). Adicionalmente, a frequência com que os animais pressionam a alavanca desenvolve-se progressivamente mais lentamente quanto maior for o FI a ser estimado. Este perfil de resposta foi acompanhado por rápidas curvas de aprendizagem, quer se tratasse da aprendizagem entre a passagem de um intervalo curto para um longo ou o inverso. Paralelamente, começámos por tentar identificar dois tipos de neurónios do corpo estriado: os neurónios de projecção D2MSNs e um tipo de interneurónios que expressam parvalbumina (PV). Para isso, usamos duas linhas de ratinhos transgénicos: uma que expressa a enzima Cre recombinase (Cre) sob o controlo do promotor para o receptor D2 (linha D2-Cre); e outra que expressa Cre sob o controlo do promotor para a PV (linha PV-Cre). Estas linhas de ratinhos trangénicos foram sujeitas a micro-injecções de um virus adeno-associado (AAV) contendo um gene de fusão que codifica um canal iónico activado por luz, a channelrhodopsin-2 (ChR2), ligado a uma yellow fluorescent protein (YFP). Como a expressão de ChR2-YFP é dependente de dupla recombinação pela enzima Cre e as duas linhas de ratinhos transgénicos expressam Cre sob o controlo de dois promotores distintos, a acção do sistema cre-lox permite-nos expressar ChR2-YFP nestes dois tipos específicos de neurónios do corpo estriado. Através de técnicas de histoquímica, marcamos ainda os núcleos (no caso da linha D2-Cre) e corpos celulares (no caso da linha PV-Cre) destes neurónios para uma melhor análise anatómica. Observamos que em cada linha transgénica estudada (D2-Cre e PV-Cre), os tipos de neurónios identificados possuem as características morfológicas de neurónios D2MSNs ou de interneurónios PV, respectivamente. Observamos ainda a existência de pequenas inclusões fluorescentes presentes praticamente em todas as áreas onde existem células infectadas por virus. Algumas alternativas foram já pensadas de forma a evitar esta observação que parece ser um sinal de expressão elevada da proteína de fusão. Serão necessárias futuras experiências para avaliar até que ponto estas inclusões alteram a as propriedades electrofisiológicas das células, assim como o efeito a expressão de ChR2-YFP por si só. Com este trabalho, demos um passo importante para conseguirmos no futuro isolar subpopulações de neurónios e identifica-los durante gravações electrofisiológicas. Neurónios que expressem ChR2 serão identificados electrofisiolgicamente recorrendo à técnica PINP (Photostimulation-assisted Identification of Neuronal Populations): uma vez estimulados com luz azul, a activação ChR2 causará uma despolarização da membrana do neurónio, e este produzirá um potencial de acção. Este efeito tornará possível identificar estes neurónios por técnicas extra-celulares de electrofisiolgia enquanto os animais são testados na tarefa de SFI. Desta forma, poderemos estudar que tipo neuronal codifica que tipo de informação durante o processo de cronometragem. Esta informação poderá aprofundar o nosso conhecimento sobre os circuitos neuronais que estão na base deste processo fundamental. A compreensão da forma como integramos e processamos informação temporal poderá ainda ter enormes vantagens no estudo de doenças neuro-degenerativas como as doenças de Parkinson e Huntington.

The ability to time intervals in the range of seconds-to-minutes-to-hours, (interval timing) is a fundamental aspect of learning and behavior. Although many theoretical models have set out to address how the brain may process temporal information, little is known about the neural mechanisms that underlie this fundamental ability. Many studies indicate that the basal ganglia (BG) is the brain structure most involved in interval timing, but we still don’t know how the BG might process and encode duration information. Neurophysiological recording from single cells in a situation where a subject must access learned duration information provides a powerful tool to investigate interval timing mechanisms. However, information about neural cell type and connectivity within BG networks will ultimately be necessary to understand how timing information is computed, stored, and read out to guide behavior. We want to train transgenic mice in a dynamic paradigm and try to identify which signals are carried by which cell types during timing behavior. To achieve this, we trained mice in a new dynamic schedule, the Serial Fixed Interval (SFI) task. Animals showed a reliable response pattern that co-varied with the time duration being sampled and learned to adjust their response time rapidly in response to interval changes. To ultimately identify recorded cell type during the SFI task, we used channelrhodopsin-2 to label two subpopulations of striatal neurons. We used adeno-associated virus to deliver channelrhodopsin-2 in to the striatum of two transgenic mouse lines in which the expression of the enzyme Cre was driven either by the parvalbumin promoter or by the dopamine type-2 receptor promoter. Together, these results suggest that transgenic mice can be used in a highly dynamic timing paradigm, and that we may identify recorded cell types during such behavior, providing a powerful opportunity to study the neuronal circuit mechanisms of interval timing.