Understanding the interactions between retroviral vectors and the genome of human keratinocytes

Abstract

Retroviruses are a unique family of infectious agents, its diverse life cycle and survival strategies have been an important object of study to modern biology. The integration pattern of gamma-retroviruses (RV) and lentiviruses (LV) in the human genome follows a non-random very distinct distribution, but the precise factors involved in choice of the integration sites are still unknown. To further study this question, RV (MLV) and LV (HIV) integration sites were mapped after infection of primary human keratinocytes with vectors derived from these viruses. 3020 and 1601 unique sites for MLV and HIV, respectively, were retrieved and analysed for correlation with several genomic sites. Moreover, a comparative analysis between the new dataset and previously obtained datasets on lymphocytes T and haematopoietic stem cells Cd34+ was performed to understand the involvement of the cellular program in viral integration choices. The outcome of this project suggests substantial differences in the molecular mechanisms tethering RV and LV PICs to human chromatin. Both vectors’ integration locates preferably inside genes and target mostly active genes with a higher frequency in lymphocytes, these characteristics showed a higher frequency in HIV’s integrations. MLV is attracted to TSS proximal regions with a higher frequency in lymphocytes, while HIV is repelled by these regions independently of the cell-type. MLV positively associates with epigenetic markers of promoters and enhancers and has a higher integration in evolutionary conserved non-coding sequences in mammals (CNCs). Additionally it targets regions rich in transcription factor binding sites (TFBS) with a cell-specific pattern, revealing a possible preference for functional TFBS rather then a general feature preference. HIV associates with epigenetic markers for the body of transcribed genes and has no preference for CNCs. HIV showed a more widely distributed integration, with clusters that spread through much larger regions of the genome and, therefore, target more genes then MLV’s clusters which have a more packed distribution. Analysis of gene function revealed some cell-specificity in MLV’s targets although common genes probably related to the transcription machinery are also highly targeted. HIV targets genes involved essentially in general cell-functions. Furthermore we predict that retroviruses choose early replicating regions of the genome to integrate. Since primary human keratinocytes are clinically relevant in gene therapy for correction of inherited skin diseases, safety parameters related to both vectors were also analysed. The results of this study predict that HIV has a lower probability of generating insertional gene activation events that could lead to oncogene activation. Furthermore, since MLV has a more cell-specific integration pattern, there’s a different probability of integrating near specific oncogenes according to the cell-type. Findings of this work reveal cellular specific patterns of integration as well as common integration preferences, clarifying the cellular machinery’s role in integration site-selection mechanism. Overall these results strengthen models for integration targeting based on tethering of viral components to host proteins and suggest a higher involvement of the cellular transcriptional machinery in MLV’s integration in comparison to HIV’s.

Os retrovírus fazem parte de uma família única de agentes infecciosos; as particularidades do seu ciclo de vida, a forma como interagem com o hospedeiro e as consequências desta interacção têm sido objecto de estudo fulcral da biologia moderna. O impacto dos retrovírus na sociedade actual é inegável e a busca pela sua compreensão tem direccionado esforço e recursos da comunidade científica. O processo de integração retroviral no genoma humano é de primordial importância uma vez que, dele depende a sobrevivência do vírus no hospedeiro. A integração dos retrovírus segue um padrão não-aleatório que varia entre as diversas famílias virais, podendo-se facilmente identificar uma família retroviral pelas suas preferências na escolha do local de integração (Bushman, 2005). Apesar dos mecanismos envolvidos nas reacções de corte e ligação do genoma viral ao do hospedeiro serem já bastante conhecidos, os factores envolvidos na escolha do local de integração são ainda uma questão em aberto. Para tentar compreender melhor esta questão, mapeei 3020 locais únicos de integração de moloney leukaemia virus (MLV) e 1601 locais de integração de human immunodeficiency virus (HIV) no genoma de queratinócitos humanos primários. Sendo MLV da família oncoretroviridae e HIV da família lentiviridae, procurei estabelecer as semelhanças e diferenças no processo de escolha do local de integração de cada um. A par de analisar as preferências integrativas neste tipo celular, realizei uma análise comparativa com dados anteriores obtidos em células estaminais hematopoiéticas (HSC) Cd34+ e linfócitos T de forma a tentar compreender o envolvimento do programa celular nas escolhas integrativas. Os resultados deste trabalho demonstram que MLV, membro da família gamma-retroviridae, e HIV, da família lentiviridae, apresentam padrões de integração não aleatórios muito distintos. Os vírus em estudo apresentam diferenças substanciais nos mecanismos moleculares que atraem os complexos de pré-integração viral (PICs) para a cromatina humana revelando estratégias evolutivas muito diversas. Ambos os vectores se integram preferencialmente dentro de genes e maioritariamente em genes activos, com uma frequência mais elevada em linfócitos. Estas características demonstraram-se mais exacerbadas nas integrações de HIV. MLV é atraído por regiões próximas de transcription start sites (TSS), com uma frequência mais elevada em linfócitos, enquanto HIV é repelido por estas mesmas zonas do genoma com igual frequência em todos os tipos celulares. Ambos os vírus se integram preferencialmente dentro de genes em comparação com o controlo, no entanto, esta preferência é bastante mais acentuada em HIV, em particular em linfócitos, apresentando mais de 80% das integrações em genes em comparação com 50% das integrações de MLV. Genes com expressão activa são candidatos preferenciais para a integração viral, incluindo ≈70% dos hits únicos. Esta preferência é privilegiada nas integrações dentro de genes de HIV, sendo mais elevada em Cd34+HSC quando comparada com queratinócitos. MLV, mas não HIV, revela alguma preferência por zonas do genoma conservadas não-codificantes (CNCs) entre mamíferos e relaciona-se positivamente com regiões ricas em transcription factor binding sites, com um padrão particular para cada tipo celular. Esta particularidade sugere uma preferência por TFBS activos mais do que uma preferência geral pela vizinhança destas regiões genómicas. Foram também analisados diversos marcadores epigenéticos para os diversos tipos celulares. Esta análise revelou uma forte associação de MLV a regiões com promotores e enhancers e uma associação negativa a zonas com marcadores geralmente associados a cromatina inactiva ou repressão da expressão génica. Por outro lado, HIV associa-se positivamente a marcadores epigenéticos para o corpo de genes transcritos e negativamente para marcadores de regiões com promotores e enhancers, assim como zonas de cromatina inactiva. Clusters de integração viral foram definidos estatisticamente, tendo em conta o tamanho da amostra e a distância entre uma integração e a integração consecutiva. Verificou-se que MLV apresenta clusters com maior densidade de integração, enquanto os clusters de HIV se expandem através de uma área mais vasta da cromatina. Consequentemente, os clusters de HIV incluem um maior número de genes relativamente a MLV. Através da utilização do programa Ingenuity analisei os genes alvo de ambos os vírus relativamente à sua função em todos os tipos celulares. Verifica-se que MLV tem como alvo genes específicos do tipo celular assim como genes relacionados com funções mais gerais. HIV integra-se essencialmente em genes com funções de regulação da expressão génica. Seguidamente, coloquei a hipótese de que as integrações retrovirais se localizariam em zonas dos cromossomas que se replicam cedo durante o ciclo replicativo, uma vez que, estas zonas se relacionam com zonas de cromatina activa assim como com genes de elevada expressão em determinado tipo celular. Apesar de considerar os resultados com alguma cautela, tendo em conta a reduzida informação disponível em relação ao tempo de replicação, é previsível uma forte correlação com zonas dos cromossomas que replicam cedo, por parte de ambos os vírus. Uma vez que os vírus estudados são aplicáveis ao nível da terapia génica de doenças epiteliais hereditárias, verifiquei alguns parâmetros de segurança relativamente a ambos os vectores virais. Após confronto de uma lista de common insertion sites e oncogenes com os genes alvo de MLV e HIV, prevê-se que os lentivírus sejam vectores mais seguros no entanto, dadas as limitações das análises, não foi possível concluir com bastante fiabilidade sobre esta questão. A partir do seu padrão de integração, é possível que os gamma-retrovirus tenham desenvolvido um mecanismo que tira proveito da maquinaria celular transcripcional para promover a sua própria expressão, ligando integração do provírus com regiões de elevada actividade no genoma, ricas em TFBS, TSS, promotores, enhancers e com uma conformação epigenética característica de uma cromatina activa. Isto sugere um modelo no qual factores de transcrição (TFs) ubíquos ligados aos complexos de pré-integração (PICs) de retrovírus, interagem com componentes gerais dos complexos de ligação a enhancers, por exemplo co-reguladores, complexos de remodelação da cromatina ou complexos mediadores, em vez de TFs ou famílias de TFs específicas. A ligação dos PICs a fábricas transcripcionais, onde promotores e regiões regulatórias são relocalizadas através de mecanismos específicos do tipo celular, pode ser a causa dos clusters específicos com alta frequência de integração de MLV assim como do targeting preferencial de genes associados a redes regulatórias específicas do tipo celular. Trabalhos recentes dão suporte a esta hipótese, propondo uma interacção directa entre integrase e remodelação da cromatina, reparação de DNA e factores transcripcionais. De um ponto de vista evolutivo, esta cooperação pode ser interpretada como o desenvolvimento dos mecanismos através dos quais os retrotransposões escolhem regiões alvo específicas através da ligação a proteínas da célula hospedeira. Um mecanismo ligando selecção de locais alvo a regulação génica pode ter evoluído para maximizar a probabilidade de que os gammaretrovírus sejam transcritos no genoma da célula-alvo e, possivelmente para induzir a expansão das células infectadas através de desregulação insercional de reguladores de crescimento específicos do tipo celular. Por outro lado, os lentivírus desenvolveram uma estratégia totalmente diferente, interagindo com muito menos interferência com a cromatina e maquinaria celular do hospedeiro, isto é, não provocando situações de desregulação insercional uma vez que não escolhem a proximidade de regiões regulatórias para se integrar. Esta estratégia prolonga o tempo de vida das células hospedeiras e consequentemente do hospedeiro, aumentando a probabilidade de disseminação viral para novos hospedeiros. Este trabalho contribui assim significativamente para aprofundar as questões da integração retroviral no genoma humano, assim como para inferir sobre a segurança da utilização de vectores virais em doenças hereditárias da pele.