Global and local effects of pigmentation in Bicyclus anynana

Abstract

The astounding diversity, ecological relevance and insights into the underlying development, make butterfly wing pigmentation an excellent model for evo-devo. These two-dimensional colour patterns depend on two sequential phases during pupal development: transcription factors first give patterning information to cells, and effector enzymes then produce specific colour pigments that are deposited in the developing scale-cells that will decorate the adult wings. The sequence of pigment deposition occurs in a stereotypical order, and the time of scale maturation is strongly correlated with scale colour. However, the relationship between colour and the time of maturation of scale-cells remains to be understood. We use two spontaneous mutants of a butterfly lab model to explore this relationship. Melanine mutants, with a global change darken the whole body and Fred mutants with a local. In this project we characterize the developmental timing of pigmentation in these mutants. We use ISH and semi-quantitative PCR to determine the genetic expression of candidate genes for pigmentation. Our results show that in melanine mutants pigment deposition occurs as in “wild-type” butterflies, but subsequent modifications darken the whole wing to produce overall darker adults. This is consistent with a role for a pigment biosynthesis enzyme in producing the melanine phenotype. In Fred mutants, atypically-coloured scales in a particular location of the wing do not mature at the same time as those of the same colour in other parts of the wing. Rather, they mature at a time that is characteristic of that particular wing location in “wild-type” butterflies. This suggests that the position on the wing, rather than the specific colour of the scale cells is related to their timing of maturation. By genotype-phenotype association mapping we excluded black as responsible for melanine phenotype. Unfortunately, ISH results are not robust, but semi-quantitative PCR results suggest a role for yellow gene in melanine phenotype.

A diversidade morfológica observada nos animais é um dos temas mais intrigantes e controversos em biologia evolutiva, que ao longo do tempo se tem dedicado a estudar não só os mecanismos de especiação como também a origem e evolução de novas morfologias e planos corporais que irromperam na vida animal. De forma a compreender a diversificação evolutiva e o potencial adaptativo das espécies é essencial estudar as vias ontogénicas, uma vez que o desenvolvimento traduz os genótipos em fenótipos, e a variação fenotípica será a base de actuação da selecção natural. A pigmentação animal tem sido associada a fenómenos ecológicos importantes, como a termoregulação, foto-protecção, resistência à desidratação, reconhecimento sexual, mimetismo, aposematismo, estratégias crípticas, entre outras. Contudo determinada coloração nem sempre surge por pressão selectiva, também pode surgir por oportunidade, por exemplo por deriva genética ou em linkage com outra característica que estará a ser seleccionada. A perda de pigmentação em animais cavernícolas é um exemplo que tem envolvido muita especulação sobre o seu papel adaptativo. Os padrões de coloração que os animais exibem têm uma fantástica variação, mesmo entre espécies próximas, indivíduos da mesma espécie ou em indivíduos da mesma população. São um dos traços característicos chave na forma como os animais interagem com o seu ambiente biótico e abiótico. Vários são os estudos que apontam para o carácter pleiotrópico dos genes responsáveis pela pigmentação envolvidos em características importantes como a resposta imunitária, o comportamento, resistência à desidratação, entre outras, demonstrando que a pigmentação não é só fascinante pelos padrões que se observam mas também pelas vias que utiliza. Pela sua diversidade de padrões de pigmentação nas asas, fácil manuseamento e disponibilidade em laboratório de mutantes na pigmentação, várias espécies de borboletas tem sido estudadas na tentativa de se perceber melhor os processos envolvidos na diversidade fenotípica. Os pigmentos são depositados numa camada simples de células epidérmicas, que no caso das borboletas são escamas. Cada escama apresenta uma só cor, sendo portanto o conjunto das escamas de várias cores que permite a existência de padrões diferentes. O padrão de coloração surge no estádio de pupa tardia, mesmo antes da eclosão do adulto. . A enorme variedade de padrões tem inspirado muitos modelos teóricos explicativos para a sua formação. Nijhout propôs um modelo para a evolução dos padrões de cores das borboletas, que acenta nos vários elementos padronizantes que compõem as asas das borboletas, como os veios, as bandas, organizadores locais, bifurcações e as margens. Estes elementos permitem uma compartimentação da asa que no caso da pigmentação iria determinar os padrões. Apesar das inúmeras aplicações deste modelo, não permite explicar a enorme variação dos padrões encontrados nem a sua formação. Sendo por isso necessário o estudo das vias de desenvolvimento e suas alterações. A nível genético, sabe-se que a formação dos padrões de coloração em insectos em geral, ocorre em duas etapas sequenciais: primeiro factores de transcrição determinam os padrões a nível espacial e temporal, etapa realizada por genes padronizantes; seguidamente enzimas efectoras produzem os pigmentos específicos que serão depositados nas asas das borboletas. Em borboletas alguns estudos já identificaram alguns destes genes padronizantes e efectores a actuar na formação dos padrões de coloração. Carroll et al 1994, revelou a correlação entre os padrões de expressão de Distal-less, spalt e engrailed com os anéis dos ocelos – estruturas circulares compostas por um ou mais anéis e com um centro organizador - das asas de borboletas. Em Vanessa cardui, foi caracterizado pela primeira vez a expressão de três genes envolvidos na síntese de omocromos: vermilion, cinnabar e white. Em Beldade et al 2005, foram identificados nas asas ainda em desenvolvimento de Bicyclus anynana três genes presentes na pigmentação do olho de Drosophila melanogaster: vermilion, henna e ruby, que se pensa estarem envolvidos na produção de pigmentos nas asas das borboletas. E em Heliconius erato foi sugerido uma ligação entre a variação polimórfica adaptativa e os padrões de coloração com a expressão génica de vermilion e cinnabar, respectivamente. A sequência de deposição de pigmentos ocorre numa ordem estereotípica, a ordem de deposição dos pigmentos coloridos é sempre a mesma e é conservada ao longo das espécies. O tempo de maturação das escamas está fortemente correlaccionado com a cor que a escama produz. Contudo a relação entre a localização, cor e tempo de maturação das escamas continua pouco esclarecida. Neste projecto usámos dois mutantes espontâneos de uma espécie modelo de borboleta, Bicyclus anynana, para explorar melhor esta relação. Os mutantes melanine apresentam uma alteração global na pigmentação sendo muito mais escuros em todo o corpo do que o fenótipo selvagem, mutante este que numa análise a priori, parece estar a ser produzido por um gene efector. Os mutantes Fred apresentam uma alteração local comparativamente com o fenótipo selvagem, congruente com uma alteração num gene padronizante. Os nosso resultados revelam que o mutante melanine, tem um inicio de deposição de pigmentos semelhante aos indivíduos selvagens. Contudo subsequente alterações levam a um escurecimento da coloração. No mutante Fred a deposição de pigmentos decorre de acordo com a localização das escamas nas asas e não com a cor dos pigmentos, como seria de esperar. Respeitando portanto a ordem de deposição de pigmentos do fenótipo selvagem, embora apresente um padrão de coloração diferente. Durante este projecto não só descrevemos a dinâmica de deposição dos pigmentos nas asas desses mutantes, como também identificamos novos padrões na dinâmica de deposição de pigmentos no fenótipo selvagem. A deposição do pigmento de cor preta, ocorre em todos os fenótipos sempre das zonas posteriores para as zonas anteriores das asas. A segunda tarefa deste projecto consistia em identificar a base genética do mutante melanine, um mutante recessivo. Sendo os principais candidatos genes efectores da via da melanina. Para isso realizou-se o mapeamento por associação do genótipo com o fenótipo num gene candidato: black. Contudo, dos polimorfismos identificados nos pais não foi encontrada uma associação entre os genótipos e os fenótipos da descendência. Sendo necessário estender a análise para além da zona codificante do black. Através de PCR utilizando primers degenerados encontrou-se uma sequência de 560pb com grande homologia ao gene ebony de várias espécies de Papilio e Drosophila. Procurou-se comparar os padrões de expressão de alguns genes candidatos, (tan, black, ddc, yellow e pale), realizando hibridação in-situ em asas de indivíduos selvagens e mutantes melanine. Contudo os poucos padrões encontrados em indivíduos selvagens não têm repetição e estão presentes em ambas as sondas. Por serem resultados pouco confiáveis e a amostra estudada não ser significativa, os resultados obtidos na hidridação in-situ são insuficientes para qualquer conclusão. Para além da análise qualitativa, foi também realizada uma quantitativa: PCR semi-quantitativo, usando seis genes da via da melanina (ebony, pale, tan, black, ddc, yellow) e um controlo positivo (EF-alpha). Os resultados desta experiência revelaram que o gene yellow começa a ser expresso mais cedo no mutante melanine do que nos indivíduos selvagens. Sugerindo um papel importante para este gene na produção do fenótipo melânico. Mais estudos são necessários para que se possa perceber qual a base genética do mutante melanine, mas saber que o gene yellow tem uma expressão diferente do selvagem é uma boa base para futuros projectos.