Efeitos do etanol na organização lateral de bicamadas lipídicas complexas em diferentes suportes sólidos e interacção com um enzima

Abstract

A interacção do etanol com bicamadas lipídicas pode induzir a sua redução de espessura por diferentes processos – interdigitação, desordem e/ou aumento dos ângulos de inclinação das cadeias acilo dos fosfolípidos. Estas conclusões foram obtidas em estudos anteriores a partir da análise de bicamadas compostas por um lípido ou dois lípidos sem separação de fases, pelo que, alguns aspectos permanecem por esclarecer, como o papel dos domínios lipídicos na interacção com etanol. Assim, o principal objectivo deste estudo foi acompanhar, por microscopia de força atómica (AFM) em solução, as alterações induzidas pelo etanol em bicamadas lipídicas suportadas (SLB’s) contendo domínios. Diferentes sistemas lipídicos foram utilizados: um lípido puro na fase fluida (1,2-Dioleoil-sn-Glycero-3-fosfocolina – DOPC), um lípido puro na fase gel (1,2-Dipalmitoil-sn-Glicero-3-fosfocolina – DPPC), misturas binárias de fosfolípidos com coexistência de fases gel/fluida (DOPC/DPPC – 1:1) e misturas ternárias contendo jangadas lipídicas, ou seja, speração de fases líquida ordenada/líquida desordenda (DOPC/DPPC/Colesterol – 40:40:20 e DOPC/Pampitoilesfingomielina (PSM)/Col – 40:40:20). A partir das diferenças de altura observadas antes e após a adição de etanol aos sistemas puros e à mistura DOPC/DPPC, verifica-se que no sistema binário a redução de espessura da fase fluida ocorre antes do que na fase gel. Contudo, para as misturas contendo jangadas lipídicas observou-se o adelgaçamento simultâneo de toda a bicamada. Este efeito foi observado em SLB’s depositadas em mica e silício. Para todas as composições estudadas, observou-se a expansão da bicamada lipídica correspondente aos domínios mais desordenados, e concomitante aumento da sua fracção. Estes resultados mostram a capacidade do etanol influenciar as propriedades da bicamada de modos diferentes de acordo com a composição membranar. Assim, o etanol poderá exercer os seus efeitos biológicos não só por redução da espessura da bicamada, mas eventualmente por alteração da conformação e distribuição lateral de proteínas, como consequência da modificação da ordem da bicamada e da proporção de domínos ordenados versus desordenados. A deposição de SLB’s de vários componentes sobre ouro foi também estudada. Iniciou-se também o estudo da adsorção de lacase (um enzima oxidase) a uma bicamada depositada em ouro. Observou-se uma diferença de alturas numa bicamada lipídica composta por DOPC/PSM/Col em ouro correspondente a jangadas lipídicas e adsorção de lacase a esta bicamada. Este resultado pode ser o ponto de partida para estudos mais detalhados sobre a biofísica de lípidos ou para uma aplicação na área dos biossensores.

The interaction of ethanol with lipid bilayers promotes their thickness reduction by a variety of processes: interdigitation, disorder increase and/or the increasing of the tilt angle of the phospholipid acyl chain. These conclusions were achieved in previous works upon the study of lipid bilayers composed by one or two lipids without phase separation. In this way, important issues remain unclear, such as the role of lipid domains on ethanol-bilayer interactions. The main purpose of this study was to follow the changes induced by ethanol on supported lipid bilayers (SLB’s) with nano to microdomains by in situ Atomic Force Microscopy. To this goal, pure lipids in the fluid phase (DOPC) and in the gel phase (DPPC), binary phospholipid mixtures (DOPC/DPPC – 1:1) with gel/fluid phase coexistence, and ternary lipid mixtures containing cholesterol, i.e., raft forming mixtures (DOPC/DPPC/cholesterol – 40:40:20 and DOPC/sphingomyelin/cholesterol – 40:40:20) were investigated. From the height differences observed upon ethanol addition to pure lipids (DPPC and DOPC), and to the lipid mixture DOPC/DPPC we conclude that in the binary system the thickness reduction of the fluid phase occurs prior to the gel phase. However, for the two mixtures containing lipid rafts (DOPC/sphingomyelin/Cholesterol and DPPC/DOPC/Cholesterol) we observed the simultaneous thickness reduction of both raft and non raft portions of the membrane. This phenomenon occurred in both mica and silicon substrates. For all compositions studied, bilayer expansion was observed for the most disordered domains, which consequently has promoted a fraction increase of these domains. These results show the ability of ethanol to influence the bilayer properties in different ways according to membrane composition. Ethanol may exert its biological effects not only by reducing bilayer thickness, but also by changing membrane proteins conformation and lateral distribution, as a consequence of the altered properties of the lipid bilayer, namely the disordered/ordered domains proportion. The formation of multicomponents SLB on gold was also studied. It was observed for a lipid bilayer composed by DOPC/PSM/Cholesterol an height difference correspondent to a lipid raft and similar to the one obtained for an identic bilayer deposited on mica. Furthermore the adsorption of laccase (an oxidoredutase enzyme) onto the referred bilayer has been performed. Due to gold properties this may be a starting point to more detailed studies concerning lipid biophysics or to an application in biosensing area.