MicroRNAs artificiales como fuente de resistencia antiviral y diversidad
Author
Mesel Casanova, FridaEntity
UAM. Departamento de Biología Molecular; Centro Nacional de Biotecnología (CNB)Date
2018-05-17Subjects
Virología - Tesis doctorales; Biología y Biomedicina / BiologíaNote
Tesis Doctoral inédita leída en la Universidad Autónoma de Madrid, Facultad de Ciencias, Departamento de Biología Molecular. Fecha de lectura: 17-05-2018Esta tesis tiene embargado el acceso al texto completo hasta el 17-11-2019
Esta obra está bajo una licencia de Creative Commons Reconocimiento-NoComercial-SinObraDerivada 4.0 Internacional.
Abstract
La sharka es probablemente la enfermedad más importante de frutales de frutos con
hueso en Europa cuyo agente causal es el virus conocido como Plum pox virus (PPV).
La enfermedad va acompañada de elevadas pérdidas económicas, de ahí la importancia
de desarrollar procedimientos de prevención y tratamiento. La tecnología de los
microRNAs artificiales (amiRNAs) utiliza el mecanismo natural de silenciamiento de
RNA mediado por miRNAs para conseguir un efectivo silenciamiento genético post
transcripcional (PTGS) contra genes endógenos, que también se puede usar como
defensa contra patógenos. Con objeto de estudiar esta herramienta biotecnológica en
detalle para desarrollar resistencia frente al PPV y entender cómo el virus evoluciona
para escaparse de la presión antiviral, hemos desarrollado plantas transgénicas de
Nicotiana benthamiana y Prunus domestica que expresan amiRNAs dirigidos a las
regiones NIb, CP y 3´ no codificante del RNA viral. Varias líneas transgénicas que
expresan dos de estos amiRNAs mostraron protección completa contra PPV-R y
resultados preliminares de una línea de P. domestica también mostró resistencia. En las
plantas de líneas transgénicas de N. benthamiana no completamente resistentes se
originó una gran variedad de variantes virales con diferentes mutaciones en las dianas
de los amiRNAs. El análisis de la secuencia de los diferentes mutantes, que mostraba
una preferencia por los cambios en las posiciones 9 y 10 de la diana de los amiRNAs en
el genoma del PPV, sugería que la acción del amiRNA estrella sobre la secuencia
complementaria del RNA viral también contribuye a la resistencia antiviral. Esta
hipótesis fue confirmada mediante la caracterización por 5’-RACE de los sitios de corte
por RISC en plantas de N. benthamiana que expresan altas cantidades del amiRNA
dirigido a la hebra complementaria de la región CP del RNA viral. El alcance de la
resistencia antiviral se evaluó inoculando plantas de N. benthamiana transgénicas con
los aislados PPV-PS y PPV-SwCM, que pertenecen a razas distintas del aislado PPV-R.
Las plantas transgénicas que expresan un amiRNA dirigido a una región de la secuencia
codificante de la CP eran resistentes frente a los aislados de las tres razas del PPV
analizadas. Es interesante que algunos mutantes con cambios en la diana de PPV-R que
escapan de la acción de los amiRNAs imitan la secuencia nucleotídica natural de los
aislados PPV-PS y PPV-SwCM, lo que sugiere que la manera por la cual los virus
evolucionan, sea por deriva genética o bajo diferentes presiones selectivas, son
limitadas.
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