Compósitos CNTs/biocerâmico para a estimulação elétrica óssea in situ

Abstract

The present thesis aims to develop a biocompatible and electroconductor bone graft containing carbon nanotubes (CNTs) that allows the in situ regeneration of bone cells by applying pulsed external electrical stimuli. The CNTs were produced by chemical vapor deposition (CVD) by a semi-continuous method with a yield of ~500 mg/day. The deposition parameters were optimised to obtain high pure CNTs ~99.96% with controlled morphologies, fundamental requisites for the biomedical application under study. The chemical functionalisation of CNTs was also optimised to maximise their processability and biocompatibility. The CNTs were functionalised by the Diels-Alder cycloaddition of 1,3-butadiene. The biological behaviour of the functionalised CNTs was evaluated in vitro with the osteoblastic cells line MG63 and in vivo, by subcutaneous implantation in rats. The materials did not induce an expressed inflammatory response, but the functionalised CNTs showed a superior in vitro and in vivo biocompatibility than the non-functionalised ones. Composites of ceramic matrix, of bioglass (Glass) and hydroxyapatite (HA), reinforced with carbon nanotubes (CNT/Glass/HA) were processed by a wet approach. The incorporation of just 4.4 vol% of CNTs allowed the increase of 10 orders of magnitude of the electrical conductivity of the matrix. In vitro studies with MG63 cells show that the CNT/Glass/HA composites guarantee the adhesion and proliferation of bone cells, and stimulate their phenotype expression, namely the alkaline phosphate (ALP). The interactions between the composite materials and the culture medium (α-MEM), under an applied electrical external field, were studied by scanning vibrating electrode technique. An increase of the culture medium electrical conductivity and the electrical field confinement in the presence of the conductive samples submerged in the medium was demonstrated. The in vitro electrical stimulation of MG63 cells on the conductive composites promotes the increase of the cell metabolic activity and DNA content by 130% and 60%, relatively to the non-stimulated condition, after only 3 days of daily stimulation of 15 μA for 15 min. Moreover, the osteoblastic gene expression for Runx2, osteocalcin (OC) and ALP was enhanced by 80%, 50% and 25%, after 5 days of stimulation. Instead, for dielectric materials, the stimulus delivering was less efficient, giving an equal or lower cellular response than the non-stimulated condition. The proposed electroconductive bone grafts offer exciting possibilities in bone regeneration strategies by delivering in situ electrical stimulus to cells and consequent control of the new bone tissue formation rate. It is expected that conductive smart biomaterials might turn the selective bone electrotherapy of clinical relevance by decreasing the postoperative healing times.

A presente tese tem como objetivo o desenvolvimento de um substituo ósseo condutor elétrico e biocompatível, formulado com nanotubos de carbono (CNTs), que permite a regeneração in situ do osso sob a aplicação externa de estímulos elétricos pulsados. Os CNTs foram produzidos por deposição química em fase de vapor (CVD) por um método semi-contínuo com um rendimento ~500 mg/dia. Os parâmetros de deposição foram otimizados de modo a obterem-se CNTs com elevada pureza ~99.96% e morfologias controladas, requisitos fundamentais para a aplicação biomédica em estudo. A funcionalização química dos CNTs foi igualmente otimizada para maximizar a sua processabilidade e biocompatíbilidade. Os CNTs foram funcionalizados pela reação de adição Diels-Alder de 1,3 butadieno. O comportamento biológico dos CNTs funcionalizados foi avaliado in vitro com a linha celular osteoblástica MG63 e in vivo, por implantação subcutânea em ratos. Os materiais não induziram uma resposta inflamatória manifesta, mas os CNTs funcionalizados apresentaram uma biocompatibilidade in vitro e in vivo superior aos não funcionalizados. Compósitos de matriz cerâmica, biovidro (Vidro) e hidroxiapatite (HA), reforçada com nanotubos de carbono (CNT/Vidro/HA), foram processados por via líquida. A incorporação de 4.4 vol% de CNTs permitiu um aumento de 10 ordens de grandeza da condutividade elétrica da matriz. Estudos in vitro com células MG63 mostraram que os compósitos de CNT/Vidro/HA garantem a adesão e proliferação das células ósseas, e estimulam a expressão do seu fenótipo, nomeadamente a fosfatase alcalina (ALP). As interações entre os materiais compósitos e o meio de cultura (α-MEM), sob a aplicação de um campo elétrico externo, foram estudadas pela técnica do eléctrodo vibratório de varrimento. Observou-se um aumento da condutividade elétrica do meio de cultura e do confinamento de campos elétricos na presença de amostras CNT/Vidro/HA submersas no meio, relativamente às de Vidro/HA. A estimulação elétrica in vitro das células MG63 nos compósitos condutores promoveu um aumento da actividade metabólica e do teor de DNA de 130% e 60%, relativamente à condição não estimulada, após apenas 3 dias de estimulação diária de 15 μA por 15 min. Além disso, a expressão genética osteoblástica para o Runx2, osteocalcina (OC) e ALP foi aumentada em 80 %, 50 % e 25 %, após 5 dias de estimulação. Por outro lado, para materiais dielétricos, a estimulação apresentou-se menos eficiente, originando uma resposta celular igual ou inferior à situação não estimulada. Os substitutos ósseos condutores elétricos permitem a entrega in situ dos estímulos às células e consequente controlo da taxa de crescimento do novo tecido ósseo. Estes novos biomateriais condutores funcionais poderão tornar a electroterapia selectiva do osso clinicamente relevante, ao possibilitarem a diminuição dos tempos pós-operatórios.