Preparation of multifunctional polymer@gold nanostructures and assembly into multilayered thin films for biosensing

Abstract

O objetivo desta tese de mestrado era desenvolver nanoestruturas robustas e multifuncionais do tipo coroa@núcleo para servir como base num sensor biológico. A estabilidade e as propriedades óticas das nanopartículas de ouro (Au NPs), nomeadamente a ressonância de plasmão de superfície localizada (LSPR), tornam as excelentes candidatos para o desenvolvimento de biossensores baseados em SPR. No seguimento de um trabalho anterior, procedeu-se primeiro à otimização da encapsulação e funcionalização dasAu NPs. Em segundo lugar, preparou-se filmes finos de multicamadas que incorporam as nanopartículas encapsuladas. Au NPs (15  4 nm) foram sintetizadas pelo método de Turkevich, e sua superfície foi revestida por polimerização de transferência de cadeia reversível por adição-fragmentação (RAFT) assistida em encapsulante emulsão (REEP). Foram explorados dois tipos de nanoestruturas: i) nanoestruturas não funcionalizadas foram preparadas com sucesso adsorvendo um agente macroRAFT (MR) P(PEGA40)-TTC) não funcionalizado nas Au NPs, seguido pelo crescimento do bloco hidrofóbico usando uma mixtura (10:1 w/w) de metacrilato de metilo (MMA) e de acrilato de butilo (BA) a partir de MR@Au NPs; e ii) nanoestruturas funcionalizadas foram preparadas usando um agente MR funcionalizado com um bioreceptor (biotina) e um fluoróforo (isotiocianato de fluoresceína - FITC). Foram realizadas tentativas para crescer o bloco hidrofóbico apartir das nanoestruturas multifuncionais MR@Au com o objetivo de melhorar a sua resposta óptica aumentando a distância entre o núcleo e o fluoróforo. No entanto, concluiu-se que a estratégia seguida para preparar estas nanoestruturas multifuncionais tem de ser revista. O tamanho e a estabilidade das nanoestruturas de ouro foi avaliado por espectroscopia UV-Visível e fluorescência, STEM (microscopia eletrónica de transmissão de varrimento), DLS (dispersão dinâmica de luz) e medidas de potencial zeta. A caracterização química e estrutural dos polímeros foi feita por espectroscopias de 1H-RMN (ressonância magnética nuclear de protões) e de infravermelho, e cromatografia de permeação de gel – cromatografia de exclusão por tamanho (GPC-SEC). Em seguida, foram realizados testes de biodeteção usando a nanoestrutura multifuncional de coroa@núcleo no sentido de avaliar a sua resposta óptica na presença de um bioanalito específico - avidin. No entanto, estes testes não foram conclusivos devido às limitações da estratégia seguida para preparar as nanoestruturas multifuncionais. Paralelamente ao trabalho descrito acima, estudou-se a preparação de filmes finos usando o método camada a camada (Layer-by-Layber, LbL) baseado em interações electrostáticas, para isso foi usado o hidrocloreto de polialilamina (PAH) e as nanoestruturas de Au. Foram estudados alguns parâmetros nomeadamente o peso molecular, tempo de deposição, pH e força iónica, e o número de camadas. O objetivo final era depositar na última camada as nanoestruturas de ouro funcionalizadas com biotina-FITC. O procedimento para a deposição por LbL das NPs de Au encapsuladas foi realizado com sucesso, mas uma vez que os testes de biodeteção não foram conclusivos este último passo não foi efectuado.

The aim of this master thesis was to develop robust, easily prepared multifunctional shell@core gold nanostructures to serve as a basis for customization into a specific biological sensor. The stability and optical properties of gold nanoparticles (Au NPs), namely the localized surface plasmon resonance (LSPR), makes them excellent candidates for the development of SPR-based biosensors. In this work, the preparation and functionalization of the gold nanoparticles was first optimized, on the basis of the previous work. Next, multilayered thin-films embedding these gold nanostructures were prepared. Au NPs (15  4 nm) were synthetized by the Turkevich method, and their surface was coated via reversible addition fragmentation chain transfer (RAFT) assisted encapsulating emulsion polymerization (REEP). The preparation of two types of nanostructures was explored: i) non-functionalized nanostructures were successfully prepared using the macroRAFT (MR) agent P(PEGA40)-TTC) adsorbed onto Au NPs, followed the growth of a hydrophobic block using a 10:1 (w/w) mixture of methyl methacrylate and butyl acrylate from MR@Au NPs; and ii) functionalized nanostructures were prepared using a MR agent functionalized with a bio-receptor (biotin) and a fluorophore (fluorescein isothiocyanate - FITC). Attempts to grow a hydrophobic block from the multifunctional MR@Au NPs were carried out to enhance the optical response by increasing the distance between the core and fluorophore. Yet, the synthetic strategy followed to prepare this type of multifunctional nanostructures needs to be revised. The size and stability of gold nanostructures were characterized by UV-Visible and fluorescence spectroscopy, STEM (scanning transmission electron microscopy), DLS (dynamic light scattering) and Zeta potential measurements. The chemical and structural characterization of polymers was carried out by 1HNMR (proton nuclear magnetic resonance), infrared spectroscopies and gel permeation chromatography – size exclusion chromatography (GPC-SEC). Then, biosensing tests were performed on the multifunctional shell@core nanostructures synthetized to assess their optical response towards a specific bioanalyte - avidin. However, these tests were inconclusive due to the limitations of the synthetic strategy followed to prepare the Au nanostructures. Parallel to the synthetic work described above, the preparation of thin films via electrostatic interactions using the Layer-by-Layer (LbL) method was studied, using poly(allylamine hydrochloride) (PAH) and carboxylic acid terminated non-functionalized Au nanostructures. Various parameters were studied such as molecular weight, deposition time, pH and ionic strength, as well as the number of layers. The final goal was to deposit the biotin-FITC-functionalized gold nanostructure as last layer. The optimized procedure for LbL deposition of the encapsulated Au NPs was fully accomplished, in view of the fact that the biosensing tests were inconclusive, this last step was not carried out.