Uso do método LC-DAD-MS na análise de benzodiazepinas em amostras post-mortem

Abstract

A ampla difusão na utilização diária de Benzodiazepinas pela população determina a necessidade dos serviços forenses em disporem de metodologias de análise rápidas e fiáveis para amostras de sangue. Na literatura encontram-se descritas as seguintes técnicas cromatográficas para as Benzodiazepinas: cromatografia líquida de alta resolução, cromatografia gasosa, cromatografia em camada fina e cromatografia micelar electrocinética capilar. Destas, as principais são a cromatografia líquida de alta resolução e a cromatografia gasosa, sendo que o inconveniente desta última se prende com o facto das Benzodiazepinas serem termicamente instáveis e pouco voláteis. Devido ao exposto, a técnica mais usada para a análise destes compostos e dos seus metabolitos é a cromatografia líquida de alta resolução com detecção de UV-VIS ou espectrometria de massa. Nesta tese, é apresentada, numa primeira fase, uma abordagem geral relativa aos fundamentos da toxicologia e da toxicologia forense, em termos de objectivos, campo de acção, implicações da toxicocinética das substâncias nas determinações analíticas, amostragem, procedimentos de extracção e instrumentação geral. Após a compreensão da arquitectura da toxicologia forense, passa-se à explanação destes conceitos gerais com aplicação específica às Benzodiazepinas seguindo-se, então, a apresentação de uma técnica analítica para a determinação deste grupo de substâncias: cromatografia líquida de alta resolução com detecção de diode de array e espectrometria de massa (LC-DAD-MS), com isolamento prévio dos analitos por processos de extracção em fase sólida. A implementação da técnica analítica acima descrita permite um melhor aproveitamento das capacidades técnicas existentes no Serviço de Toxicologia Forense da Delegação do Norte do Instituto Nacional de Medicina Legal fornecendo, ao mesmo tempo, uma maior quantidade de informação relativa a cada processo, cuja importância é fundamental na eliminação de resultados anómalos. No que concerne ao processo de extracção, realizaram-se ensaios em amostras de sangue com colunas Oasis®HLB. A extracção usada revelou ser eficaz para as Benzodiazepinas em estudo embora a percentagem de recuperação fosse um pouco inferior a 70%. No entanto, mesmo o rendimento não ultrapassar os 70%, para todas as Benzodiazepinas é possível a sua detecção e quantificação com os valores de extracção obtidos. Relativamente à técnica cromatográfica estudada, no que diz respeito à verificação da qualidade dos resultados a técnica permite a obtenção de coeficientes de variação inferiores aos considerados aceitáveis em ensaios cromatográficos (15%). A metodologia adoptada apresentou bons limiares analíticos para todas as Benzodiazepinas em estudo, verificando-se que todas podem ser detectadas e quantificadas quando presentes em níveis terapêuticos, tóxicos e letais. Ainda quanto aos valores dos limiares analíticos obtidos, verifica-se que são mais baixos quando comparados com os obtidos por LC-DAD.

ABSTRACT: The daily widespread use of benzodiazepines has sparked the need of the forensic services to have access to fast and reliable analytical methodologies for biological fluids. In the scientific literature the majority of the analytical processes reported have a previous chromatographic separation step, which can be gas, thin layer, high performance liquid or micelar electrokinetic capillary chromatography. The main ones are the high performance liquid and gas, although this last one has two drawbacks: the benzodiazepines are thermal instable and not very volatile. So the analytical choice is the high performance liquid chromatography coupled with an UV-VIS or a mass spectrometry detector. The initial part of this thesis provides the basics of toxicology, particularly the forensic branch. In particular sampling, extraction principles, toxicokinetic behaviour of the compounds and its influence in the analytical process, and the instrumentation are reviewed. After this general introduction, the next part of the thesis is devoted to the specific case of the benzodiazepines, including a detailed description of the analytical methodology used in the experimental work: isolation of the analytes from the complex sample matrices using solidphase extraction followed by high performance liquid chromatography coupled with diode array and mass spectrometry detection. This analytical technique not only it takes advantage of the instrumentation already used at the North Branch of the Portuguese National Institute of Legal Medicine, but also the amount of information obtained is very useful to discard anomalous results. Although the recovery percentage obtained after the extraction step was slightly less than 70%, it was possible for all the studied benzodiazepines its detection and quantification. For the chromatographic technique the coefficients of variation obtained were lower than the ones usually accepted (15%), and the analytical limits were lower than the ones obtained with liquid chromatography with diode array detection. The proposed methodology makes possible to quantify numerous benzodiazepines in biological fluids at therapeutic, toxic, and lethal levels.