Receptores N-metil-D-aspartato e toxicidade do peptídeo ß-amilóide

Abstract

A doença de Alzheimer (DA) é uma doença neurodegenerativa resultado da perda irreversivel de neurónios, principalmente no hipocampo e córtex cerebral. Esta doença manifesta-se clinicamente pela perda progressiva de memória, perturbações das funções cognitivas e alterações de comportamento. Estas alterações são o A DA caracteriza-se histopatologicamente pela presença de placas senis, devido á acumulação extracelular do peptideo p-amilóide (Ap), e por tranças neurofibrilhares, resultantes da hiperfosforilação da proteína tau. A toxicidade induzida pelo peptídeo Ap está associada a excitotoxicidade, que consiste na libertação excessiva de glutamato e sobreactivação dos receptores N-metil-D-aspartato (NMDA), conduzindo ao aumento da concentração intracelular de cálcio e, consequentemente, a morte neuronal. Os receptores NMDA são compostos pelas subunidades NRI, NR2A-D e NR3A-B que se associam em vários subtipos com diferentes características funcionais e farmacológicas, e distribuem-se de forma heterogénea pelo sistema nervoso central. Neste trabalho, avaliou-se a influência de diferentes subtipos de receptores NMDA na toxicidade do peptideo A~I.~,,. Para tal, expressaram-se os subtipos NRIINRZA ou NRIINRZB em células HEK293. A exposição ao peptideo Ap1.40 diminuiu a capacidade redutora em células que expressavam NRIINRZA ou NRIINRZB. Porém, o peptideo Api.40 induziu um aumento da permeabilidade membranar, traduzida pelo aumento da libertação de lactato desidrogenase (LDH), e uma diminuição do conteúdo intracelular de ATP somente em células que expressavam o subtipo NRIINRZA. A presença de MK-801, um antagonista dos receptores NMDA, preveniu parcialmente a alteração da permeabilidade membranar e dos niveis energéticos celulares. Não se encontraram evidências de morte celular por apoptose após exposição ao Ap1.40i uma vez que não se O ~ S ~ N OaU a ctivação de caspases-2, 3, 8 e 9 ou a fragmentação de ADN. A estimulação com NMDA e glicina em células que expressavam receptores do subtipo NRIINRZA resultou num aumento dos niveis intracelulares de cálcio após a exposição ao peptideo A~I.~,,.N estas condições, não se O ~ S ~ N OaU activação de calpainas, dependentes de cálcio. Pelo contrário, a exposição a Ap1.40 diminuiu os niveis intracelulares de cálcio resultantes da estimulação dos receptores do subtipo NRIINRZB. Os resultados obtidos neste trabalho sugerem que os receptores NMDA compostos pelas subunidades NRI e NR2A medeiam preferencialmente a toxicidade induzida pelo peptideo Ap (1-40) por um processo de morte celular por necrose, devido a alteração da permeabilidade ao cálcio.

ABSTRACT: Alzheimer's disease (AD) is a progressive neurological disease that results in the irreversible loss of neurons, particularly in the hippocampus and cortex. The clinical hallmarks are progressive impairment in memory, judgment, orientation to physical surroundings and language. The histopathological hallmarks are extracellular senile plaques that contain the P-amyloid peptide (AP), and intracellular neurofibrillary tangles, composed of a hyperphosphorylated form of the microtubular protein tau. Neurotoxicity induced by AP has been documented to involve glutamate toxicity, resulting from the activation of Nmethyl- D-aspartate (NMDA) receptors, elevation of intracellular ca2+ levels and cell death (excitotoxicity). Glutamatergic NMDA receptors are composed by the subunits NRI, NRZA-D and NR3A-B that assemble in order to form different receptor subtypes. These subtypes are distributed heterogeneously throughout the brain and have different physiological and pharmacological properties. Few studies have taken into account the structural heterogeneity of the NMDA receptors. Thus, in the present study, we have examined the contribution of NRIINRZA and NRllNR2B subtypes in AP toxicity. We have used transiently transfected HEK293 cells expressing NRIINRZA and NRIINRZB subunits and analysed the citotoxicity induced by AP1.40. Cells expressing both receptor subtypes showed a decrease in cell reducing capacity upon exposure to AP1.40. Analysis of lactate dehydrogenase (LDH) release revealed that AP1~40 enhanced the toxicity induced by expression of NRIINRZA, compared to NRIINRZB, indicating loss of plasma membrane integrity. Furihermore, in cells expressing NRIINRZA, exposure to APG~doe creased intracellular ATP content. MK-801, a NMDA receptor antagonist, partially prevented both the decrease in cell viability and the energy impairment, These differences could not be accounted for the activation of caspases-2,3,8 and 9 or the fragmentation of DNA, excluding the hypothesis of apoptosis. We have also evaluated intracellular calcium levels upon stimulation with NMDA plus glycine. Stimulation of the NRIINRZA receptor subtype revealed an increase in intracellular calcium in cells pre-exposed to AP1.40, as compared to nonexposed cells. Under these conditions, calcium-dependent calpains were not activated. Opposite effects were obsewed upon activation of NRllNR2B receptors, since a decrease in intracellular calcium was obsewed upon exposure to AP1.40. These data suggest that NRIINRZA-composed NMDA receptors specifically mediate necrotic cell death in the presence of AP, through the alteration of intracellular calcium homeostasis.