Development of new therapeutic strategies for Spinal Muscular Atrophy

Author

Fuente Ruiz, Sandra de la

Director

Soler i Tatché, Rosa Ma.

Date of defense

2020-07-28

Pages

332



Department/Institute

Universitat de Lleida. Departament de Medicina Experimental

Abstract

L'Atròfia Muscular Espinal (AME) és una malaltia neurodegenerativa greu i la primera causa genètica de mort infantil. S'origina per la pèrdua o mutació del gen Survival Motor Neuron 1 (SMN1) que causa una deficiència de la proteïna de Survival Motor Neuron (SMN). La reducció d'aquesta proteïna condueix principalment a la degeneració de les motoneurones (MNs) de la medul·la espinal i, en conseqüència, produeix atròfia i feblesa del múscul esquelètic. Actualment, només es coneix parcialment quins mecanismes cel·lulars i moleculars exactes són els responsables de la pèrdua de funció de les MNs. La reducció de SMN causa degeneració de les neurites i mort cel·lular sense característiques apoptótiques clàssiques. L'autofàgia és un procés important i altament regulat, essencial per a l'eliminació d'orgànuls danyats i substàncies o proteïnes tòxiques a través de la degradació amb els lisosomes. L'autofàgia és especialment important en cèl·lules post-mitòtiques, com les MNs, on l'acumulació d’autofagosomes provoca la interrupció del transport axonal, la interferència del trànsit intracel·lular i la degeneració de les neurites. El que és ben sabut en l'AME és que el nivell intracel·lular de proteïna SMN defineix l'inici i la gravetat de la malaltia i això està parcialment determinat pel nombre de còpies del gen SMN2, la duplicació centromérica de SMN i el principal modificador de l'AME. Per aquesta raó, comprendre els processos que regulen la degradació de SMN amb la finalitat d'identificar compostos que augmentin els nivells de proteïnes és el principal objectiu en el desenvolupament terapèutic per a l’AME. Les calpaínes són una família de proteases dependents de calci que s'han relacionat amb trastorns musculars i malalties neurodegeneratives. Específicament, s'ha descrit en el múscul que SMN pot ser proteolizada per calpaína. L'activitat de la calpaína també està involucrada en la regulació de l'autofàgia mitjançant la modulació de múltiples de les proteïnes involucrades en el procés. L'objectiu en el present treball ha estat analitzar la desregulació de l'autofàgia i determinar la participació de la calpaína en la regulació de la proteïna SMN en les MNs per a aprofundir en l'origen de la neurodegeneración i desenvolupar un nou enfocament terapèutic per a l'AME. Per aquesta finalitat, hem analitzat marcadors autofágics en diferents models in vitro d’AME, tant de ratolí com d'humà. Els resultats van mostrar que, tant els autofagosomes com els nivells de LC3 es troben augmentats en les mostres d’AME en comparació amb els controls, la qual cosa suggereix una desregulació del procés d'autofàgia al llarg de la progressió de la malaltia. A més, la reducció dels nivells endògens de calpaína utilitzant un shRNA van mostrar un augment dels nivells de Smn i LC3, alhora que prevenia la degeneració neurítica que es produeix en les MNs de ratolí afectats per AME. Es van obtenir resultats similars en experiments in vitro utilitzant un inhibidor farmacològic de calpaína, la calpeptina. Tanmateix, l'activació de la calpaína produïda per condicions despolarizants induïa la proteólisis de l’α-fodrina i de SMN, la qual cosa confirma que calpain regula directament els nivells de proteïna SMN en les MNs. A més, el tractament amb calpeptina in vivo va millorar significativament l'esperança de vida i la funció motora de dos models de ratolins amb AME, la qual cosa demostra la utilitat potencial dels inhibidors de la calpaína en la teràpia per a la malaltia. Finalment, l'anàlisi de la via de la calpaína en ratolins i models cel·lulars humans d’AME va indicar un augment de l'activitat de la calpaína en les MNs amb nivells reduïts de SMN. Per tant, els nostres resultats demostren que l'activitat de la calpaína es troba sobreactivada en les MNs d’AME i que la seva inhibició pot tenir un efecte beneficiós sobre el fenotip de la malaltia a través de l'augment de SMN i la regulació del procés d'autofàgia en les MNs de la medul·la espinal.


La atrofia muscular espinal (AME) es una enfermedad neurodegenerativa grave y la primera causa genética de muerte infantil. Se origina por la pérdida o mutación del gen Survival Motor Neuron 1 (SMN1) que causa una deficiencia de la proteína de Survival Motor Neuron (SMN). La reducción de esta proteína conduce predominantemente a la degeneración de las motoneuronas (MNs) de la médula espinal y, en consecuencia, produce atrofia y debilidad del músculo esquelético. Actualmente, solo se conoce parcialmente que mecanismos celulares y moleculares exactos son los responsables de la pérdida de función de las MNs. La reducción de SMN causa degeneración de neuritas y muerte celular sin características apoptóticas clásicas. La autofagia es un proceso importante y altamente regulado, esencial para la eliminación de orgánulos dañados y sustancias o proteínas tóxicas a través de la degradación con los lisosomas. La autofagia es especialmente importante en células post-mitóticas, como las MNs, donde la acumulación de autofagosomas provoca la interrupción del transporte axonal, la interferencia del tráfico intracelular y la degeneración de las neuritas. Lo que es bien sabido en la AME es que el nivel intracelular de proteína SMN define el inicio y la gravedad de la enfermedad y esto está parcialmente determinado por el número de copias del gen SMN2, la duplicación centromérica de SMN y el principal modificador de la AME. Por esa razón, comprender los procesos que regulan la degradación de SMN con la finalidad de identificar compuestos que aumentan los niveles de proteínas es el principal objetivo en el desarrollo terapéutico de AME. Las calpaínas son una familia de proteasas dependientes de calcio que se han relacionado con trastornos musculares y enfermedades neurodegenerativas. Específicamente, se ha descrito en el músculo que SMN puede ser proteolizada por calpaína. La actividad de la calpaína también está involucrada en la regulación de la autofagia mediante la modulación de múltiples de las proteínas involucradas en el proceso. El objetivo en el presente trabajo ha sido analizar la desregulación de la autofagia y determinar la participación de la calpaína en la regulación de la proteína SMN en las MNs para profundizar en el origen de la neurodegeneración y desarrollar un nuevo enfoque terapéutico para la AME. Con este fin, hemos analizado marcadores autofágicos en diferentes modelos in vitro de AME, tanto de ratón como de humano. Los resultados mostraron que los autofagosomas y los niveles de LC3 se encuentran aumentados en las muestras de AME en comparación con los controles, lo que sugiere una desregulación del proceso de autofagia a lo largo de la progresión de la enfermedad. Además, la reducción de los niveles endógenos de calpaína utilizando un shRNA muestraron un aumento de los niveles de Smn y LC3, a la vez que previene la degeneración neuritica que se produce en las MNs de ratón afectados por AME. Se obtuvieron resultados similares en experimentos in vitro utilizando un inhibidor farmacológico de calpaína, la calpeptina. Asimismo, la activación de calpaína producida por condiciones despolarizantes inducia la proteólisis de α-fodrina y de SMN, lo que confirma que calpain regula directamente los niveles de proteína SMN en las MNs. Además, el tratamiento con calpeptina in vivo mejoró significativamente la esperanza de vida y la función motora de dos modelos de ratones con AME, lo que demuestra la utilidad potencial de los inhibidores de la calpaína en la terapia para la enfermedad. Finalmente, el análisis de la vía de la calpaína en ratones y modelos celulares humanos de AME indicó un aumento de la actividad de la calpaína en las MNs con niveles reducidos de SMN. Por lo tanto, nuestros resultados demuestran que la actividad de la calpaína se encuentra sobreactivada en las MNs de AME y su inhibición puede tener un efecto beneficioso sobre el fenotipo de la enfermedad a través del aumento de SMN y la regulación del proceso de autofagia en las MNs de la médula espinal.


Spinal Muscular Atrophy (SMA) is a severe neurodegenerative disease and the first genetic cause of infant death. It is originated by the deletion or mutation of Survival Motor Neuron 1 (SMN1) gene causing a Survival Motor Neuron (SMN) protein deficiency. The reduction of this protein predominantly leads to the degeneration of spinal cord motoneurons (MNs) and consequently produces skeletal muscle atrophy and weakness. The exact cellular and molecular mechanisms responsible for MN loss of function are only partially known. SMN reduction causes neurite degeneration and cell death without classical apoptotic features. Autophagy is an important and highly regulated process, essential for the removal of damaged organelles and toxic substances or proteins through lysosome degradation. This mechanism is specifically important in post-mitotic cells like MNs where autophagosome accumulation causes axonal transport disruption, interference of intracellular space trafficking, and neurite degeneration. What is well known in SMA is that intracellular SMN protein levels are critical to define the disease onset and severity, and this is partially determined by the number of copies of SMN2, the centromeric duplication of the SMN gene and the main modifier of SMA. For that reason, understanding the processes of SMN stability and degradation to identify compounds that increase protein levels is a major goal in SMA therapeutics development. Calpains are a family of calcium-dependent proteases that have been related to muscle disorders and neurodegenerative diseases. Specifically, it has been described in muscle that SMN can be a proteolytic target of calpain. Calpain activity is also involved in autophagy regulation by modulation of multiple proteins involved in the process. The objectives in the present work have been to analyze the autophagy deregulation and determine the involvement of calpain in SMN protein regulation on MNs, in order to deepen in the origin of neurodegeneration and to develop a new therapeutic approach for SMA disease. To this end, we have analyzed autophagic markers in different mouse and human SMA in vitro models. The results showed that autophagosomes and LC3 levels were increased in SMA samples compared to controls, suggesting a deregulation of the autophagy process throughout the disease progression. Moreover, calpain knockdown using an shRNA approach showed an increase of both, Smn and LC3 levels and prevented neurite degeneration occurred in SMA affected mouse MNs. Similar results were obtained in in vitro experiments using a pharmacological calpain inhibitor, calpeptin. Likewise, calpain activation produced by depolarized conditions induced α-fodrin and SMN proteolysis, confirming that calpain directly regulates the SMN protein level in MNs. Additionally, calpeptin in vivo treatment significantly improved the lifespan and motor function of two severe SMA mouse models, demonstrating the potential utility of calpain inhibitors in SMA therapeutics. Finally, the analysis of calpain pathway members in mice and human cellular SMA models indicated an increase of calpain activity in SMN-reduced MNs. Thus, our results show that calpain activity is increased in SMA MNs and its inhibition may have a beneficial effect on the SMA phenotype through the increase of SMN and the regulation of the autophagy process in spinal cord MNs.

Keywords

Atròfia Muscular Espinal; Motoneurones; Calpaina; Atrofia Muscular Espinal; Motoneuronas; Spinal Muscular Atrophy; Motoneurons; Calpain

Subjects

576 - Cellular and subcellular biology. Cytology

Knowledge Area

Biologia Cel·lular

Documents

Tsfr1de1.pdf

4.484Mb

 

Rights

ADVERTIMENT. Tots els drets reservats. L'accés als continguts d'aquesta tesi doctoral i la seva utilització ha de respectar els drets de la persona autora. Pot ser utilitzada per a consulta o estudi personal, així com en activitats o materials d'investigació i docència en els termes establerts a l'art. 32 del Text Refós de la Llei de Propietat Intel·lectual (RDL 1/1996). Per altres utilitzacions es requereix l'autorització prèvia i expressa de la persona autora. En qualsevol cas, en la utilització dels seus continguts caldrà indicar de forma clara el nom i cognoms de la persona autora i el títol de la tesi doctoral. No s'autoritza la seva reproducció o altres formes d'explotació efectuades amb finalitats de lucre ni la seva comunicació pública des d'un lloc aliè al servei TDX. Tampoc s'autoritza la presentació del seu contingut en una finestra o marc aliè a TDX (framing). Aquesta reserva de drets afecta tant als continguts de la tesi com als seus resums i índexs.

This item appears in the following Collection(s)