Caracterización de las vesículas de membrana de Shewanella vesiculosa M7(T)

Abstract

La presente Tesis Doctoral se enmarca en el proyecto CTQ2014-59632-R concedido por el ministerio de economía y competitividad al grupo de investigación. El trabajo se ha centrado en caracterizar las vesículas de membrana (VM) de Shewanella vesiculosa M7T y explorar potenciales aplicaciones. Esta bacteria gramnegativa procedente de la Antártida fue descrita por nuestro grupo y ha sido usada como cepa modelo por la gran cantidad de VM que forma. Actualmente se acepta que las bacterias gramnegativas pueden formar distintos tipos de VM y que existen diferentes mecanismos de vesiculación implicados. A su vez, la formación de vesículas depende de diversos factores fisiológicos y ambientales. Todo ello, provoca que las VM de una población bacteriana puedan ser diversas en cuanto a su contenido y funciones, lo que les permite actuar en diversos procesos fisiológicos bacterianos. En estudios anteriores se demostró que S. vesiculosa M7T produce vesículas de membrana externa (VME) ya descritas y un nuevo tipo de vesículas que se denominaron vesículas de membrana externa e interna (VME-I) ya que se formaban por evaginación conjunta de ambas membranas y podían arrastrar contenido del citoplasma bacteriano como DNA. Las VME-I han suscitado un notable interés científico, de modo que un objetivo principal de esta tesis ha sido intentar separarlas del resto de VM de S. vesiculosa M7T para poder estudiar su contenido y su mecanismo de formación. La separación se ha conseguido mediante sorting por citometría de flujo de alta resolución, pero no en cantidades suficientes para poder trabajar con ellas. De todos modos, los estudios de citometría de flujo, junto con los de microscopía electrónica de transmisión y de crio-microscopía electrónica, han confirmado que la cantidad y tipo de vesículas producidas por S. vesiculosa M7T varía en función de su fase de crecimiento. Los diferentes ácidos nucleicos presentes en las VM han sido objeto de estudio en los últimos años con el objetivo de entender posibles mecanismos de regulación intercelular o de transferencia horizontal génica. En este trabajo, la secuenciación del genoma de S. vesiculosa M7T y del DNA contenido en sus VM, han confirmado que el genoma de la cepa estaba completamente representado en los fragmentos contenidos en las VM de cultivos de 24 y 48 horas. Además, permitió identificar la presencia de un fago lisogénico insertado en el genoma de la cepa. Por otro lado, a las 24 h de cultivo se han podido observar procesos de muerte celular programada (PCD). Este hecho, junto la presencia del genoma completo en los fragmentos de las VM, la identificación de un fago lisogénico y las imágenes de microscopía electrónica, han confirmado que en los cultivos de S. vesiculosa M7T se activa a las 24 horas, un proceso de lisis celular de una fracción de la población. Esta lisis es similar a la descrita como “lisis celular explosiva” por otros autores y da lugar a la formación de VME y VME-I mediante la recircularización de fragmentos de membranas

de células explosionadas, lo cual confiere una gran heterogeneidad a la población de VM de S. vesiculosa M7T. Por tanto, podemos decir que existen dos mecanismos de formación de VME-I, el ya descrito por el grupo de extrusión conjunta de las dos membranas y el de la simple recircularización de fragmentos de membrana externa e interna generados en un proceso de lisis celular mediada por un fago. Las VM de algunas bacterias gramnegativas pueden contener otros componentes del citoplasma como ATP. Tanto las VM como el ATP extracelular (eATP) se han relacionado con la formación de biofilms. En este trabajo se ha estudiado la posible correlación entre la presencia de eATP en las VM y la capacidad de formar biofilms por parte de cepas antárticas descritas anteriormente por nuestro grupo de investigación. En la mayoría de las cepas analizadas, no se observó correlación entre estos estos factores estudiados. Solamente S. vesiculosa M7T secretó altos niveles de eATP y sus VM provocaron un aumento significativo en la velocidad y la cantidad de biofilm formado. También se observó que una gran parte del eATP está contenido dentro de las VM, protegido de la degradación enzimática, y que el ATP influye en la formación del biofilm. En relación al estudio de aspectos aplicados de las vesículas de S. vesiculosa M7T, se ha analizado la actividad bactericida de las VM de S. vesiculosa M7T frente a diversas cepas gramnegativas y grampositivas, tanto cepas procedentes de la Antártida como cepas de interés clínico. Las vesículas sólo han inhibido el crecimiento de bacterias grampositivas por su capacidad de degradar el peptidoglicano de dichas cepas, probablemente por la presencia de enzimas de tipo peptidoglicanasas. Sin embargo, la heterogeneidad y complejidad de las mezclas de VM han dificultado la reproducibilidad de los resultados, descartando su uso como antibióticos.