Entwicklung und Miniaturisierung heterogener Fluoreszenz-Bioassays basierend auf FRET in Nanoliterkavitäten aus Kunststoff

Abstract

In dieser Arbeit wurden zwei heterogene Assays basierend auf FRET entwickelt und auf dem Nanotiterplattenformat miniaturisiert. Im Phasenseparation Fluoreszenz-immunoassay (PSFIA) wurde gezeigt, dass ein kompetitiver heterogener Fluoreszenzimmunoassay in Nanotiterplatten (NTP) mit einem Fassungsvolumen von 75 nL pro Kavität durchführbar war, indem man den strahlungslosen Energietransfer an der heterogenen Phase als waschschrittfreies Trennprinzip einsetzte. Ein wichtiger Punkt des heterogenen Nachweisformates bestand darin, Protokolle für die Oberflächenchemie auf mikrostrukturierten Kunststoffträgern zu etablieren. Die Oberfläche musste sowohl affnitätsbindende als auch fluoreszenzlöschende Eigenschaften haben. Die einfachste Methode war, die NTP mit einem Protein adsorptiv zu belegen. Dazu wurde beispielhaft BSA immobilisiert, an welches sowohl das Analytderivat Atrazincapronsäure als auch der Akzeptorfarbstoff Cy5.5 gekoppelt waren. Im PSFIA wurde der Cy5-markierte Antikörper Anti-Atrazin eingesetzt, um dessen Bindungstaschen der Analyt in Lösung und das immobilisierte Analytderivat konkurrierten. Mit dieser Immobilisierungsstrategie konnte im PSFIA Atrazin mit einer Nachweisgrenze (LOD) von 0,03 µg/L detektiert werden. Die LOD konnte noch weiter herabgesetzt werden, indem man mit Gold-NTPs arbeitete. Dazu wurde die Kunststoff-NTP mit einem dünnen Goldfilm bedampft. Gold hatte für den PSFIA mehrere positive Eigenschaften. Die Goldbeschichtung verursachte eine Intensivierung der Fluoreszenz in Lösung, wenn man die Fluoreszenz in Reflektion aufnahm. Für Abstände, die kleiner als 10 nm waren, wurde die Lebensdauer des angeregten Zustandes durch den strahlungslosen Energietransfer dominiert. Dieser Effekt wurde im PSFIA auf Gold-NTPs erfolgreich eingesetzt. Die Signaldynamik zwischen maximaler Fluoreszenzlöschung und maximaler Fluoreszenzintensität lag bei den Gold-NTPs bei etwa 40% und war damit doppelt so hoch wie bei den ABS-NTPs. Für Atrazin wurde eine LOD im PSFIA mit Gold-NTPs von 0,015 µg/L bestimmt. Auf den Gold-NTPs wurden aber auch Nachweisverfahren für kleinere Moleküle (z.B. Histamin und Estradiol) entwickelt. Diese Analytderivate konnten nicht direkt immobilisiert werden, so dass ein kopplungsfähiges Schichtsystem über SAMs aufgebaut wurde. Die goldbedampften Kavitätenwände wurden mit dem Thiol 11-Mercaptoundecansäure beschichtet, an das über Peptidchemie die Analytderivate gekoppelt wurden. Mit dieser Oberflächenchemie ließen sich sowohl Histamin als auch Estradiol in pM-Bereich nachweisen. Insgesamt gesehen, konnte mit dem PSFIA auf NTPs gezeigt werden, dass in Nanoliterkavitäten heterogene fluoreszenzbasierte Nachweissysteme etabliert werden konnten. Die Sensitivität war sogar vergleichbar mit dem ELISA. Gleichzeitig waren die Inkubationszeiten im PSFIA in Nanoliterkavitäten aufgrund der geringeren Diffusionswege zur Oberfläche im Vergleich zu MTP-Kavitäten stark verkürzt. Der zweite Teil der Doktorarbeit befasste sich damit, ein heterogenes Nachweissystem für die DNA-Analytik in Nanoliterkavitäten zu entwickeln. Hierfür wurde der 3’-Exonuklease-Assay auf der NTP etabliert. Dieser Assay wies unmarkierte DNA nach, indem diese an eine immobilisierte FRET-DNA-Sonde hybridisierte und eine doppelstrangspezifische Exonuklease den Doppelstrang erkannte und fragmentierte. Bei diesem Nuklease-Schritt wurde das FRET-Ereignis unterbrochen, wobei die Fluoreszenzintensität anstieg. Für die Entwicklung des Exonuklease-Assays musste eine doppelstrangspezifische Nuklease gefunden und charakterisiert, so wie die Oberflächenchemie für die Immobilisierung von DNA-Sonden auf Kunststoffoberflächen und die FRET-DNA-Sonde selbst entwickelt werden. Als geeignete Nuklease wurde die Exonuklease III gefunden, die Nukleobasen doppelsträngiger DNA vom 3’-Ende ausgehend hydrolysierte. Ihr enzymatisches Verhalten wurde sowohl mit der Kapillargelelektrophorese (CGE) als auch auf einem optischen Biosensor, der RIfS-TIRF-Kopplung, und in einem Phasenseparationsassay im Mikrotiterplattenformat untersucht. Daraufhin wurde die Miniaturisierung des Assays in Nanoliterkavitäten untersucht. Dazu wurden die Gold-NTPs eingesetzt, auf die fluoreszenzmarkierte DNA-Sonden über Thiol-Linker immobilisiert wurden. Der Fluoreszenzmarker wurde an der Goldschicht gelöscht und in Lösung stieg die Lösung in Abhängigkeit zur DNA-Konzentration an. Durch die geringen Diffusionswege wurde die LOD gesenkt. Es konnte gezeigt werden, dass der PSFIA als sensitives Nachweissystem für Analyte im Umwelt-, Screening- und Diagnostikbereich eingesetzt werden kann. Der 3’-Exonuklease-Assay konnte für die DNA-Analytik in Nanoliterkavitäten etabliert werden. Beide Assay-Formate lieferten Erkenntnisse für die miniaturisierten heterogenen Assays in der Hochdurchsatzanalytik. Grundlegend dafür waren die Erkenntnisse für die Oberflächenchemie auf den mikrostrukturierten Kunststoffoberflächen und das Prinzip des FRET an der heterogenen Phase.

Two heterogeneous assays using FRET were developed and miniaturisized on the nanotiter plate format. It was proved with the Phaseseparation Fluorescence Immunoassay (PSFIA) that a competitive heterogeneous fluorescence immunoassay is accomplishable with sample carrier who had a filling volume of 75 nL per cavity called nanotiter plate (NTP). The radiationless energy transfer at the heterogeneous phase was used as separation principle of bound and free fluorescent labeled antibodies without using any washing steps. The establishment of protocols for the surface chemistry of microstructured polymer carriers were an important point of the heterogeneous format. In principle, the surface had two features: first is the affinity binding between a receptor and a ligand at the surface and second is the fluorecence quenching as well at the surface. The ligand was immobilized at the surface and a radiationless energy transfer occured between the fluorescent antibody and the surface. A simple method was to immobilize a protein adsorptively. As an example bovine serum albumine was used. The protein was labeled with Cy5.5 as aceptor dye and the analyte derivative atrazine caproic acid was coupled to this conjugate. As receptor was taken the Cy5 labeled anti-atrazine antibody. The analyte atrazine and the immobilized analyte derivative were in competition with the binding pocket of the antibody. With this strategy of immobilisation atrazine was detected with a limit of detection (LOD) of 0.03 µg/L. The LOD was decreased working with gold layered NTPs. Gold has some advantages for the PSFIA. If reflection is the fluorescence detection method, the thin layer of gold increases the fluorescence intensity in solution. For distances less than 10 nm the lifetime of the excited state is dominated by radiationless energy transfer to the metal substrate. This effect was adopted effectively by the PSFIA on Gold-NTP. The dynamic of the signal between maximimum of fluorescent quenching and maximum of fluorescence intensity was by gold NTPs at 40%. This was two time higher as by the plastic NTPs. 0.015 µg/L of atrazine was determined as LOD with the gold NTP. The PSFIA on gold NTPs was developed as a detection methods as well for small molecules (histamine as a mediator of allergy, the hormone estradiole). It was not possible to immobilize their analyte derivatives directly to the surface. It was established a functional self assembled monolayer (SAM) on the gold layered surface. The walls of the cavities were layered with the thiol 11-mercaptoundecanoic acide. The analyte derivatives were coupled to the surface with methods of the peptide chemistry. Histamine and estradiole were detected with this surface chemistry within the sub nanomolar range. Altogether, it could shown with the PSFIA on NTPs that heterogeneous assays in nanoliter cavities are establishable. The sensitivity was comparable to a standard ELISA. But in the same time the incubation time was reduced with the PSFIA. These caused on the short diffusion distances at nanoliter cavities in comparison to the MTP. The second part of the dissertation deals with a heterogeneous assay in the NTP for the analysis of DNA. Therefore the 3‘-exonuclease assay was established on NTP. This assay could detect unlabeled DNA. The DNA hybridize to an immobilized FRET-DNA-probe. The complex was recognized of a double strand specific exonuclease who makes fragments of them. The FRET event was destroyed and the fluorecence intensity increased. A double strand specific exonuclease had to be found for the development of the exonuclease assay. This exonuclease was characterisized, the surface chemistry for the immobilisation of DNA probes on plastic surfaces and the FRET-DNA probe were developed. A useful nuclease was the exonuclease III from Escherichia coli. This nuclease hydrolizes nucleobases of double stranded DNA from the 3‘-end. The enzymatic character was analysed with capillar gel electrophorese (CGE), with a special optical Biosensor (coupling of RIfS and TIRF) and the phase separation assay in microtiter plate format. The miniaturisation of the assay were examined by using gold NTPs. Fluorescent labeled DNA probes were immobilized via a thiol-linker. The fluorescent label was quenched at the gold layer and the fluoresence increased depending on the DNA concentration. With shorter diffusion distances the detectable concentration of DNA was decreased. It was shown that the PSFIA is a sensitive assay for analytes in the environmental, screening and diagnostic field. The 3‘-exonuclease assay was established for the analysis of DNA in nanoliter volumes. Both assays formats have given input for the miniaturisation of heterogeneous assays in high throughput analysis. Elementary were the work of a surface chemistry on microstructured plastic surfaces and the principle of FRET at heterogeneous phase.