Monitoring development of chemoresistance to cyclin-dependent kinases inhibition by two-dimensional liquid phase protein fractionation

0042104 - ÚŽFG 2007 RIV GB eng C - Konferenční příspěvek (zahraniční konf.)
Skalníková, Helena - Halada, Petr - Hajdúch, M. - Vydra, D. - Dzubak, P. - Dziechciarková, M. - Strnad, M. - Kovářová, Hana
Monitoring development of chemoresistance to cyclin-dependent kinases inhibition by two-dimensional liquid phase protein fractionation.
[Sledování vzniku chemorezistence k inhibici cyklin-dependentních kináz pomocí dvojrozměrné kapalinové separace proteinů.]
Third Annual European Symposium on Protein Fractionation and Biomarker Discovery. Oxford: Worcester College, 2006, s. 1.
[Third Annual European Symposium on Protein Fractionation and Biomarker Discovery. Oxford (GB), 12.09.2006-13.09.2006]
Grant CEP: GA ČR GA301/05/0418
Výzkumný záměr: CEZ:AV0Z50450515; CEZ:AV0Z50200510
Klíčová slova: cyclin-dependent kinases
Kód oboru RIV: EB - Genetika a molekulární biologie

Cyclin-dependent kinases (CDKs) are key regulators of cell cycle, differentiation and apoptosis. Deregulation of CDKs in many cancer cells has motivated the effort to develop pharmacologically active CDK inhibitors. In this study, we used proteomic approach to monitor response of T-lymphoblastic leukaemia CEM cell line to synthetic CDKs inhibitor, Bohemine. We have compared Bohemine effects on CEM line susceptible to this drug and on a Bohemine resistant cell line derived from CEM line by culture in presence of sub-lethal Bohemine doses. Proteins were separated by two-dimensional liquid chromatography PF 2D system (Beckman Coulter) using chromatofocusing in the first dimension followed by reversed phase HPLC. Changes in protein composition after Bohemine treatment of sensitive and resistant CEM line were evaluated and differently expressed proteins were selected for identification by mass spectrometry. In susceptible cells, down-regulation of three histone variants in response to CDKs inhibition indicated that anti-cancer activity of Bohemine may be associated with epigenetic regulation. Futhermore, down-regulation of Crk-like scaffold adaptor protein was found and verified by immunoblot and immunohistochemistry for in vitro and in vivo drug treatment, respectively. Crk-like protein represents a new important target of CDK inhibition in T-lymphoblastic leukaemia. Response of resistant cells was associated with increase in the level of many chaperones/stress proteins.

Cyklin-dependentní kinázy (CDK) jsou klíčovými regulátory buněčného cyklu, diferenciace a apoptózy. Poruchy regulace CDK u mnoha nádorových buněk vyústily ve snahu vyvinout farmakologicky účinné CDK inhibitory. Syntetické trisubstituované deriváty purinu včetně Boheminu specificky inhibují CDK1 rodinu kináz a jsou novou generací potenciálních protinádorových léčiv. V této studii jsme použili proteomický přístup ke sledování odpovědi nádorových buněk k Boheminu. Použit byl model lidské T-lymfoblastické leukémie - CEM buněčná linie vnímavá k Boheminu. Navíc, kultivací v nízkých dávkách Boheminu byla odvozena CEM-R kultura rezistetní k tomuto léčivu. Proteiny byly separovány dvojrozměrnou kapalinovou chromatografií PF 2D (výrobce Beckman Coulter), která v první dimenzi používá chromatofokusaci následovanou HPLC s reverzní fází. Po vyhodnocení změn v proteinovém složení CEM a CEM-R buněk po ošetření Boheminem byly rozdílně regulované proteiny identifikovány pomocí hmotnostní spektrometrie. U buněk citlivých k Boheminu byly nalezeny snížené hladiny tří variant histonů, které vypovídají, že protinádorový účinek Boheminu může být spojen s epigenetickou regulací genové exprese. Dále bylo pozorováno snížení hladiny Crk-like scaffold adaptor proteinu a toto snížení bylo navíc potvrzeno immonublotem a immunohistochemií pro in vitro a in vivo působení léčiva. Crk-like protein je novým významným cílem CDK inhibice u T-lymfoblastické leukemie. Odpověď rezistentních buněk na působení Boheminu byla spojena s indukcí mnoha chaperonů a stresem indukovaných proteinů. Výsledky získané při separaci proteinů pomocí ProteomeLab PF2D jsou komplementární k výsledkům z 2-D elektroforézy a umožňují širší analýzu proteinů a drah, které jsou spojeny s protinádorovou léčbou.
Trvalý link: http://hdl.handle.net/11104/0135412