Implications des proprotéines convertases lors d'infections : de l'activation du pathogène au contrôle de l'immunité
Other titre : Involvement of the proprotein convertases during infections : from pathogens activation to immunity control
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Publication date
2013Author(s)
Gagnon, Hugo
Subject
Proprotéines convertasesAbstract
Résumé: Les proprotéines convertases (PC) sont d'importantes enzymes principalement impliquées dans l'activation par clivage de précurseurs protéiques dans la voie de sécrétion cellulaire. Ce processus essentiel permet de générer des polypeptides biologiquement actifs qui associent les PC à la régulation d'une diversité de processus de la physiologie animale, dont le système neuroendocrinien. Toutefois, les PC ont un rôle très particulier lors d'infections, puisqu'elles participent à la fois à l'activation de divers pathogènes et au contrôle de la réponse immunitaire induite par ceux-ci. Avec le besoin criant de nouvelles cibles thérapeutiques pour lutter contre les infections virales et bactériennes, les PC deviennent donc une nouvelle cible thérapeutique à investiguer. Néanmoins, si une thérapie antivirale ou antibactérienne ciblant les PC est envisagée, elle devra permettre d'atteindre un équilibre entre inhiber l'activation du pathogène et favoriser une réponse immunitaire appropriée, et ce tout en maintenant les fonctions normales des PC dans le maintien de l'homéostasie. Cette thèse présente donc le développement d'un inhibiteur peptidique de PC à des fins thérapeutiques contre les pathogènes et se penche sur le rôle de PC 1/3, qui est principalement associée au système neuroendocrinien, dans le contrôle de la réponse immunitaire au sein des macrophages. Il est important de mieux comprendre ce nouveau rôle de PC 1/3 jusqu'ici peu décrit, car il pourrait avoir des implications dans la balance de la réponse immunitaire lors de thérapies ciblant les PC. Dans un premier temps, l'inhibiteur de PC a été optimisé grâce à une approche peptidomimétique afin de bloquer l'activation de deux pathogènes par les PC, l'un viral : l'hémagglutinine (HA5) de la grippe aviaire hautement pathogénique (HPAI) H5N1, et l'autre bactérien : la toxine de Shiga de la forme entérohémorragique d'E coli. La relation structure-activité a été étudiée pour améliorer la stabilité, la puissance d'inhibition et la non-toxicité du peptide dans le but de bloquer de manière efficace la fusion cellulaire induite par HA5 et la toxicité de la toxine de Shiga en essais cellulaires. Dans un second temps, l'utilisation d'outils de contrôle de l'expression génique (shRNA) sur un modèle de macrophages en culture NR8383 et du modèle de souris où PC 1/3 est inactivée ont permis de déterminer les conséquences physiologiques et moléculaires de l'inactivation de PC 1/3 au sein des macrophages grâce au développement d'une approche par spectrométrie de masse. L'imagerie par spectrométrie de masse a permis de déterminer la distribution moléculaire de médiateurs peptidiques dans la rate de souris KO qui a par la suite été corrélée avec une désorganisation de divers acteurs de la réponse immunitaire. De plus, une approche d'identification protéique Gel LC-MS/MS a permis de faire le pont entre le phénotype immunitaire physiologique et la réponse moléculaire de l'inactivation de PC1/3 grâce à des analyses bio-informatiques. L'approche par spectrométrie de masse s'est avérée être un catalyseur dans cette recherche et a pu être appliquée à l'étude de tissus de patientes atteintes du cancer de l'ovaire, démontrant ainsi tous les avantages de cet outil. En somme, les résultats de cette thèse montrent la faisabilité d'inhiber les PC pour contrôler les infections et ouvrir de nouvelles perspectives sur le contrôle de l'immunité en établissant les bases moléculaires du rôle de PC1/3 dans le maintien de l'homéostasie immunitaire||Abstract: The proprotein convertases (PCs) are important enzymes mainly involved in the activation of protein precursors into the cell secretory pathway. This critical activation step that generates various biologicaliy active polypeptides makes the PCs a cornerstone in a variety of biological process, including the neuroendocrine system. However, the PCs are described as very special players during infection, since they both activate various pathogens and control the immune response they induce. With the critical need for new therapeutic targets to fight against viral and bacterial infections, the PCs thus become an interesting therapeutic avenue. However, if PCs are considered for antibacterial or antiviral therapy, it will have to achieve a balance between inhibiting infections agents activation and promoting an appropriate immune response, while maintaining the critical homeostasis functions of PCs. Therefore, this thesis presents the development of a PCs peptide inhibitor for therapeutic purposes against pathogens and examines the role of PC1/3, which is mainly associated with the neuroendocrine system, in the control of the immune response in macrophages. It is important to understand this new role of PC 1/3, because it could have implications in the balance of the immune response during therapies targeting PCs. As a first step, the PC inhibitor has been optimized by a peptidomimetic approach to block pathogens activation by PC for both, a viral pathogen (hemagglutinin of highly pathogenic avian influenza H5N1 (HA5)) and a bacterial pathogen (Shiga toxin form enterohaemorrhagic E. coli). The stucture-activity relationship has been studied to improve the stability, the inhibition power and a low toxicity profile in order to efficiently block HA5 induced cell fusion and Shiga toxin induced toxicity in cell-based assays. In a second step, gene expression control tools have been used (shRNA) on a macrophage NR8383 cell line combined with the use of PC 1/3 inactivated mouse (KO) to determine the physiological and molecular consequences of PC 1/3 inactivation in macrophages by the mean of mass spectrometry approaches. Mass spectrometry imaging was used to determine the molecular distribution of peptide mediators in the spleen of KO mice that were subsequently correlated with disorganization of various actors in the immune response. In addition, a gel LC-MS/MS proteomic approach (combined with an appropriated bioinformatics analysis) helped to correlate the immunological phenotype of PC 1/3 inactivation to the molecular level. The mass spectrometry approaches were proven to be a catalyst in this research and were further applied on ovarian cancer tissues studies, demonstrating the benefits of these tools. Overall, the results of this thesis demonstrate the feasibility of inhibiting PC to control infections and establish new avenues to modulate immunity by laying the foundations of PC 1/3 molecular functions in the maintenance of immune homeostasis.