Expressão e avaliação da atividade da hialuronidase (Poly p 2) do veneno de Polybia paulista (Hymenoptera: Vespidae) em Escherichia coli sob baixas temperaturas
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Data
2021-07-31
Autores
Pinto, Lucas Machado
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Editor
Universidade Estadual Paulista (Unesp)
Resumo
Hyaluronidase (HYAL) is an enzyme widely distributed in nature, found in the venom of invertebrates, vertebrates and in human organs and fluids. This enzyme acts as a diffusion factor, through the degradation of hyaluronic acid, which makes up the extracellular matrix of vertebrates, and can thus be used as an adjuvant to increase the dispersion and absorption of injectable pharmacological drugs. Due to the low amounts of hyaluronidase found in nature and its difficult isolation, the production of this enzyme has been carried out through heterologous expression systems, the most common being the bacterium Escherichia coli. However, due to the lack of post-translational machinery, most of the proteins are expressed in E.coli in an insoluble form, requiring the refolding process to become biologically active, which often causes the loss of part of the material. Therefore, aiming at future biotechnological applications of this enzyme, this study sought to obtain and optimize the recombinant expression of hyaluronidase from Polybia paulista wasp venom (rPoly p 2; 39kDa) in E. coli, in soluble and active form, by means of low temperatures of expression – 8ºC, 10ºC and 12ºC. In parallel, the inclusion bodies obtained in these processes were solubilized and the proteins subjected to refolding in order to recover the enzyme activity. The results showed a higher productivity of rPoly p 2 in soluble and active form when expressed at 10ºC for 48h, compared to temperatures of 8 and 12ºC. On the other hand, the inclusion body solubilization and refolding treatments were not efficient for the enzyme recovery under the conditions tested here. The evaluation and comparison of enzyme activity levels between treatments showed significant levels of rPoly p 2 activity from the soluble fractions in relation to those obtained from the refolding processes and from the positive control (ryPoly p 2) expressed in Komagataella phaffii yeast. However, none of the treatments reached the levels of hyaluronidase activity observed in the crude venom extract of P. paulista. These data, in addition to showing the feasibility of using the prokaryote system in the production of this enzyme in its soluble form, also indicate that a significant saving in the costs of purification of this protein can be achieved, which is extremely relevant in biotechnological terms.
A hialuronidase (HIAL) é uma enzima amplamente distribuída na natureza, sendo encontrada no veneno de invertebrados, vertebrados e em órgãos e fluídos humanos. Essa enzima atua como um fator de difusão, pela degradação do ácido hialurônico, que compõe a matriz extracelular de vertebrados, podendo assim, ser utilizada como adjuvante para aumentar a dispersão e absorção de drogas farmacológicas injetáveis. Devido às baixas quantidades de hialuronidase encontradas na natureza e seu difícil isolamento, a produção desta enzima tem sido realizada por meio de sistemas de expressão heterólogas, sendo o mais usual, a bactéria Escherichia coli. Entretanto, devido à falta de maquinário pós-traducional, grande parte das proteínas são expressas em E.coli de forma insolúvel, necessitando do processo de refolding (reenovelamento) para se tornarem biologicamente ativas, o que muitas vezes causa perda de parte do material. Sendo assim, visando futuras aplicações biotecnológicas desta enzima, este estudo buscou obter e otimizar a expressão recombinante da hialuronidase do veneno da vespa Polybia paulista (rPoly p 2; 39kDa) em E. coli, na forma solúvel e ativa, por meio de baixas temperaturas de expressão – 8ºC, 10ºC e 12ºC. Em paralelo, os corpos de inclusão obtidos nestes processos, foram solubilizados e as proteínas submetidas ao refolding objetivando recuperar a atividade da enzima. Os resultados mostraram uma maior produtividade de rPoly p 2 na forma solúvel e ativa quando expressa a 10ºC por 48h, relativamente às temperaturas de 8 e 12ºC. Por outro lado, os tratamentos de solubilização dos corpos de inclusão e refolding, não foram eficientes para a recuperação da enzima sob as condições aqui testadas. A avaliação e comparação dos níveis de atividade 5 enzimática entre os tratamentos demonstrou níveis significativos de atividade da rPoly p 2 proveniente das frações solúveis em relação àqueles obtidos nos processos de refolding e do controle positivo (ryPoly p 2) expresso em levedura Komagataella phaffii. No entanto, nenhum dos tratamentos atingiu os níveis de atividade hialuronidásica observado no extrato de veneno bruto de P. paulista. Estes dados, além de mostrarem a viabilidade do uso do sistema procarioto na produção dessa enzima em sua forma solúvel, também indicam que uma significativa economia nos custos de purificação desta proteína pode ser alcançada, o que é extremamente relevante em termos biotecnológicos.
A hialuronidase (HIAL) é uma enzima amplamente distribuída na natureza, sendo encontrada no veneno de invertebrados, vertebrados e em órgãos e fluídos humanos. Essa enzima atua como um fator de difusão, pela degradação do ácido hialurônico, que compõe a matriz extracelular de vertebrados, podendo assim, ser utilizada como adjuvante para aumentar a dispersão e absorção de drogas farmacológicas injetáveis. Devido às baixas quantidades de hialuronidase encontradas na natureza e seu difícil isolamento, a produção desta enzima tem sido realizada por meio de sistemas de expressão heterólogas, sendo o mais usual, a bactéria Escherichia coli. Entretanto, devido à falta de maquinário pós-traducional, grande parte das proteínas são expressas em E.coli de forma insolúvel, necessitando do processo de refolding (reenovelamento) para se tornarem biologicamente ativas, o que muitas vezes causa perda de parte do material. Sendo assim, visando futuras aplicações biotecnológicas desta enzima, este estudo buscou obter e otimizar a expressão recombinante da hialuronidase do veneno da vespa Polybia paulista (rPoly p 2; 39kDa) em E. coli, na forma solúvel e ativa, por meio de baixas temperaturas de expressão – 8ºC, 10ºC e 12ºC. Em paralelo, os corpos de inclusão obtidos nestes processos, foram solubilizados e as proteínas submetidas ao refolding objetivando recuperar a atividade da enzima. Os resultados mostraram uma maior produtividade de rPoly p 2 na forma solúvel e ativa quando expressa a 10ºC por 48h, relativamente às temperaturas de 8 e 12ºC. Por outro lado, os tratamentos de solubilização dos corpos de inclusão e refolding, não foram eficientes para a recuperação da enzima sob as condições aqui testadas. A avaliação e comparação dos níveis de atividade 5 enzimática entre os tratamentos demonstrou níveis significativos de atividade da rPoly p 2 proveniente das frações solúveis em relação àqueles obtidos nos processos de refolding e do controle positivo (ryPoly p 2) expresso em levedura Komagataella phaffii. No entanto, nenhum dos tratamentos atingiu os níveis de atividade hialuronidásica observado no extrato de veneno bruto de P. paulista. Estes dados, além de mostrarem a viabilidade do uso do sistema procarioto na produção dessa enzima em sua forma solúvel, também indicam que uma significativa economia nos custos de purificação desta proteína pode ser alcançada, o que é extremamente relevante em termos biotecnológicos.
Descrição
Palavras-chave
Hyaluronidase, Heterologous expression, Refolding, Polybia paulista, Wasp venom, Biologia molecular, Escherichia coli, Himenóptero, Proteínas recombinantes, Redobramento de proteína