Hbv Bağımlı Karaciğer Fibrozunda Hücresel Yolakların Araştırılması

Abstract

Karaciğerde fibroz kronik hasara cevap olarak meydana gelen yara iyileşme sürecine bağlı gelişerek karaciğerde aşırı ekstrasellüler matriks ve hasarlı doku birikimine sebep olur. Karaciğerde oluşan bu hasarlı doku birikimi, organın kasılma hareketlerine bağlı olarak kan akışını engeller. Bu durum da, progresif karaciğer hasarına ve fibrozun son aşaması olan sirozu takiben karaciğer yetmezliği, portal hipertansiyon ve hepatoselüler karsinoma (HCC) gibi daha vahim sonuçlara yol açabilir. Fibroz, kronik karaciğer hastalıklarının (viral hepatit, alkole bağlı ya da alkolden bağımsız steatohepatit, toksik karaciğer hasarı, otoimmün hastalıklar ve bazı genetik hastalıklar) en belirgin sonucudur. Karaciğer fibrozu genellikle progresif lineer bir olay olarak değerlendirilse de klinik çalışmalar fibroz gelişiminin her zaman sabit bir hızla ve doğrusal bir patern ile meydana gelmediğini göstermektedir. Karaciğer fibrozunun etiyolojisine bakılmaksızın kimi insanlarda hızlı bir şekilde siroz gelişimi gözlenirken kimilerinde fibroz oluşumu çok yavaş gerçekleşmekte ya da hiç gerçekleşmemektedir. Bu durumu sadece çevresel koşullara bağlamak mümkün değildir. Özellikle Hepatit B enfeksiyonunda klinik sonuç (kronik aktif hepatit, inaktif hepatit, fibroz gelişimi, siroz oluşumu vb.) virüsün replikasyon durumuna ve konağın virüse verdiği immün yanıta göre değişkenlik göstermektedir. Kronik hepatit B hastalarının hangisinde hızlı bir şekilde fibroz veya siroz gelişiminin meydana geleceğinin tahmin edilmesi son derece önem teşkil etmekte olup fibroz gelişiminde rol alan hücresel yolakların iyi bir şekilde tanımlanmasını gerektirmektedir. Bu tez çalışması, Hepatit B virüsü (HBV) ile enfekte hastalarda fibroz gelişimine odaklanarak kronik hepatit B’nin nedenlerini ve sonuçlarını kapsayan, birbirleriyle bağlantılı iki bölümden oluşmaktadır. Tezin ilk bölümü HBV enfeksiyonunda karaciğer fibrozu gelişimi ile ilişkili yolakların proteomik yöntemler aracığıyla belirlenmesini içermektedir. Tezin ikinci bölümü ise konağın immün profili ve kronik hepatit B’de görülen farklı klinik sonuçlar (aktif ya da inaktif hastalık seyri, siroz, virolojik alevlenme vb.) arasındaki ilişkiyi araştırmaktadır. Tezin ilk bölümünde, HBV ile enfekte 47 hastanın (F1: n = 7, F2: n = 20, F3: n = 12, F4: n = 3, F5: n = 2, F6: n = 3) doku örneklerinin iki boyutlu diferans jel elektroforezi (2D-DIGE) yöntemi kullanılarak proteomik taraması gerçekleştirilmiştir. Bu yöntem, tek bir jelde birçok protein örneğinin analizini sağlayarak daha doğru ve hassas proteomik kantitasyon sağlamaktadır. İki boyutlu jel elektroforezi (2-DE) binlerce proteini 2 boyutta öncelikle izoelektrik noktalarına, ardından kütlelerine göre ayrıştırabilen oldukça yüksek çözünürlüğe sahip bir yöntemdir. 2D-DIGE ise bu yöntemin daha gelişmiş bir versiyonu olup tek bir jelde birden çok örneğin incelenmesine izin vermektedir. Bunu sağlayan, her bir protein örneğinin yapısal olarak aynı fakat spektral özellikleri farklı olan floroforlarla (Cy2, Cy3, Cy5) kovalent xxiv modifikasyonunun gerçekleşmesidir. Her bir jelde Cy3 ve Cy5 floroforlarıyla etiketlenmiş 2 örnek ve çalışmadaki tüm örneklerden eşit miktarda barındıran Cy2 ile etiketlenmiş bir dahili standart incelenir. Böylece hem yapılacak olan jel sayısı azaltılır, hem de dahili kontrol sayesinde jeller arası varyasyonlar azaltılarak daha doğru ve hassas proteomik kantitasyon yapılabilir. 2D-DIGE deneyleri sonucunda tespit edilen farklı fibrotik düzeylerin proteomik profili student’s T-test (tek değişkenli analiz) ile analiz edilerek anlamlı bulunan protein spotları (p < 0.05) jelden kesilerek kütle spektrometresi ile bu spotların ait olduğu protein sekansları tespit edilmiş ve belirlenen proteinler immün-blotlama ile de doğrulanmıştır. Belirlenen proteinlerin fonksiyonel ilişkileri ve ekspresyon profilleri EnrichNet uygulamaları ve String veribankası kullanılarak belirlenmiştir. Doku örneklerinde, farklı fibrotik düzeylerde değişim gösteren proteinler şunlardır: keratin 5 (KRT5), aneksin A4 (ANX A4), apolipoprotein A1 (APOA1), immünoglobin kappa zinciri C bölgesi (IGKC), aldehit dehidrojenaz 2 (ALDH2), alkol dehidrojenaz 1 (ADH1A1), fenazin biyosentez-benzeri domen içeren protein (PBLD), transferrin (TRFE), glutamat dehidrojenaz 1 (DHE3), piruvat kinaz PKM (KPYM), peroksiredoksin 3 (PRDX3), gliseraldehit-3-fosfat dehidrojenaz (GAPDH). EnrichNet uygulaması üzerinden yapılan Reactome ve KEGG veribankası analizleri ile String analizleri çalışmaları sonucunda platelet atılımı, glikoliz ve HDL bağımlı lipid transport yolaklarının HBV kaynaklı karaciğer fibrozunda etkili olduğu gösterilmiştir. Ayrıca, literatür araştırmalarının da etkisiyle HBx proteinin bir etkileşim partneri olan hipoksiya ile tetiklenen HIF-1α proteinin glikoliz yolağındaki değişimlerden ve fibrozda görülen mitokondriyal hasardan sorumlu olabileceği kanısına varılmıştır. Tezin ikinci bölümü, konağın HBV enfeksiyonuna immün cevabının incelenmesini içermektedir. Bu amaç doğrultusunda insan lökosit antijenleri (HLA) DQB1 ile DRB1 allellerinin kronik hepatit B enfeksiyonu ile ilişkisi araştırılmış ve HLA-DQB1 allellerinin genetik olarak düşük bariyerli ilaçlarla HBV tedavisinde virolojik alevlenmeye etkisi incelenmiştir. Oral yollu antiviral ilaçlarla kronik hepatit B tedavisi oldukça uzun bir süreçtir. Bu tedavi sürecinde, özellikle de virüsün tek bir nükleotid mutasyonu ile direnç kazanabileceği düşük bariyerli ilaçlar kullanılıyorsa, antiviral direnç çok önemli bir husustur. Konak immünitesinin de bu antiviral direnç kazanma mekanizmasında önemli bir rol oynadığı bilinmektedir. Bahsi geçen bu ilaç direncinin ilk klinik işareti ise tıp terminolojisinde “virologic breakthrough” olarak geçen viral alevlenmedir. Konak immünitesinin çok önemli bir parçası olan İnsan lökosit antijenleri (Human Leukocyte Antigens = HLA) kompleksi, 6. kromozom üzerinde, kısa kolda (6 p23.1) 6 Megabaz (Mb) yer işgal eden bir gen grubudur. HLA gen ürünleri, bağışıklık sistemi yanıtının özgüllüğünü, organ naklinde doku uyumunu ve bazı otoimmün hastalıklara yakalanma riskini belirlerler. En çok bilinen genler HLA sınıf I ve HLA sınıf II gen kompleksleridir ve insan genomunda en polimorfik olan bölgedendirler. HLA sınıf II genlerinden sentezlenen majör MHC sınıf II molekülleri olan HLA-DP, HLA-DQ ve HLA-DR’de peptid bağlayan bölgede, hem alfa hem de beta alt ünitesinde değişkenlik gözlenir. HLA-DP alfa zinciri HLA-DPA lokusundan, HLA-DP beta zinciri HLA-DPB lokusundan, HLA-DQ alfa zinciri HLA-DQA lokusundan, HLA-DQ beta zinciri HLA-DQB lokusundan, HLA-DR alfa zinciri HLA-DRA lokusundan, HLA-DR’nin 4 farklı beta zinciri HLA-DRB1, DRB3, DRB4, DRB5 lokuslarından kodlanır. HLA sınıf I moleküllerleri tümör immünolojisinde, hücre-içi patojenlere karşı yanıtta rol alırken HLA sınıf II molekülleri çoğunlukla antijen sunan hücreler tarafından eksprese edilirler ve antijen sunan hücrelerin, hücre dışına saçılmış peptitleri fagosite ederek ya da dendritik hücrelerde olduğu gibi, stres altındaki hücrelerin prezente ettiği hücre içi peptitleri CD+ T lenfositlere sunarak, xxv kazanılmış bağışıklık yanıtının başlamasına sebep olurlar. Bu bölümde de ilk olarak HLA-DQB1 allellerinin virolojik alevlenme olaylarına etkisini incelenmiştir. Bu doğrultuda 198 kronik hepatit B hastasının HLA-DQB1 alleleri sekans-spesifik primer-polimeraz zincir reaksiyonu (SSP-PCR) yöntemi ile genotiplendirilerek DQB1 allelerinin virolojik alevlenme gösteren ve göstermeyen gruplar arası dağılımı analiz edilmiştir. Sonuç olarak, DQB1*05:03 allelinin virolojik alevlenme göstermeyen grupta daha sık görüldüğü (28.4% vs 12.4%, p = 0.006) tespit edilmiştir. Tek değişkenli analizler sonucunda da HBeAg seropozitivitesi (p < 0.001), siroz gözlenmeme durumu (p = 0.007), genç yaş (p = 0.002) ve tedavi öncesi yüksek logDNA miktarlarının (p < 0.001) virolojik alevlenme olayları ile ilişkili olduğu gözlenmiştir. Fakat çok değişkenli analizler sonucunda sadece logDNA (p < 0.001) ve DQB1*05:03 allelinin (p = 0.02) virolojik alevlenme olayları ile anlamlı ilişkisi olduğu gösterilmiştir. Son olarak da konak immün profilinin kronik hepatit B enfeksiyonun klinik sonuçlarına etkisi incelenmiştir. Bu doğrultuda, 355 kronik hepatit B hastasının HLA-DQB1 ve DRB1 alleleri SSP-PCR yöntemi ile genotiplendirilerek sirozlu hasta grubu ile kronik aktif hepatit B hasta grubu arasında allellerin dağılımı analiz edilmiştir. Çalışma sonucunda 355 hastada en sık rastlanan HLA DQB1 alleli olarak DQB1*03:01 (48.2%) ve en sık rastlanan HLA DRB1 alleli olarak HLA DRB1*13/14 (51.8%) tesptit edilmiştir. HLA-DQB1*05:01 alleli kronik aktif hepatit B hastalrında inaktif hastalara nazaran daha sık gözlenmektedir (27% vs 9.1%, p = 0.002, pc = 0.026). HLA-DRB1*07 alleli ise sirozlu hastalarda sirozsuz hastalara nazaran daha nadir gözlenmektedir (3.4% vs 16%, p = 0.002, pc = 0.022). Bunun dışında ileri yaş (p < 0.001) ve erkek cinsiyeti (p = 0.008) siroz varlığını etkileyen diğer etmenler olarak gözlenmiştir. Çok değişkenli lojistik analizler sonucunda, DRB1*07 halen sirozun negatif yönlü bir prediktörü olarak görülmektedir (p = 0.015). Biyoinformatik analizler de DRB1*07 allelindeki aminoasit değişimlerinin T-hücresi tanıma bölgesinde değişimlere yol açarak hipoimmün bir profile yol açabileceğini göstermektedir. Sonuç olarak, tezin proteomik kısmındaki çalışmalar platelet atılımı, glikoliz ve HDL-bağımlı lipid transportu yolaklarının HBV ile enfekte hastalarda fibroz gelişimi ile ilişkili olduğunu göstermektedir. Ayrıca, tezin genomik bölümündeki çalışmalar da HLA alleleri düzeyinde incelenen konak immünitesinin hem oral antiviral ilaçlarla tedavi sırasında meydana gelebilecek virolojik alevlenme olaylarına etkisi olduğunu hem de hepatit B enfeksiyonu sonucundaki klinik tabloya (hastalığın gelişimi, siroz gözlenmesi vb) etki ettiğini göstermektedir. Bu sonuçlar doğrultusunda, tez çalışması bir bütün olarak platelet atılımı, glikoliz ve HDL-bağımlı lipid transportu yolaklarında meydana gelen proteomik değişimlerin ve hastaların HLA profillerinin HBV ile enfekte hastalarda siroz oluşumunda etkili olduğunu göstermektedir. Bu bağlamda yapılan tez çalışması, farklı fibroz düzeylerini doku örnekleri düzeyinde inceleyen ilk çalışma olarak bu alanda yapılacak olan diğer çalışmalara ışık tutacaktır. Bu öncü çalışma sonucunda belirlenen yolaklar, daha ileri çalışmalarla incelenerek HBV hastalarında fibrozun önlenmesi için tasarlanacak yeni tedaviler için ve de fibroz düzeylerinin invasif olmayan yöntemlerle teşhis edilebilmesi için tespit edilecek biyobelirteçler için önemli bir hedef teşkil edecektir.

INVESTIGATION OF CELLULAR PATHWAYS IN HBV ASSOCIATED LIVER FIBROSIS