Bacillus Subtilis’de Sinr Ve Lutr Transkripsiyon Faktörlerinin Bacabcdeywfg Operonu Üzerine Düzenleyici Etkisi

Abstract

Bacillus subtilis Gram-pozitif bakterilerin en iyi karakterize edilmiş bir üyesidir. Doğada toprakta kolaylıkla bulabileceğimiz bir bakteri türüdür. Değişken çevre koşullarına karşı yüksek adaptasyon yeteneğine sahiptir. Bacilllus subtilis sıcaklık, oksijen, pH ve besin miktarına bağlı olarak kendi fizyolojik durumunu değiştirebilen bir organizmadır. Besin kaynağının sınırlı olduğu durumlarda kemotaksis ve katı yüzeyde kayabilme gibi sistemleri uyarabilir. Çevresindeki alternatif besin kaynaklarından yararlanabilmek için hücre dışına parçalıyıcı enzim salgılama ve yabancı DNA’nın hücre içine alınabilmesi için kompetans geliştirebilir. Bulunduğu ortamdaki rakipleriyle mücadele edebilmek için geniş spektrumlu antibiyotikler salgılayarak hayatta kalmaya çalışır. Son olarak, eğer çevre koşulları tamamiyle elverişşiz hale gelirse sporlanmaya yönlenebilen Bacillus subtilis en zor koşullarda bile hayatta kalmayı başaran bir organizmadır. Bacillus subtilis’in yaklaşık olarak 4,2 Mbp uzunluğunda olan genomu tamamiyle dizilenmiştir ve genomunun neredeyse 4100 genin kodlanmasından sorumlu olduğu ortaya çıkarılmıştır. Bununla beraber patojen olmaması, kolay kültüre alınması, tranforme olabilme, yüksek adaptasyon yeteneği ve çok sayıda enzim ve antibiyotik üretebilmesi bilimsel araştırmalarda ve endüstride tercih edilmesinin en önemli nedenleridir. Bacillus subtilis çevresindeki rakipleriyle mücadele edebilmek için çok sayıda mekanizmaya sahiptir. Bunlardan en önemlisi antibakteriyal, antifungal ve antimetabolik özellikleri olan antibiyotikleri üretebilmesidir. L-alanine ve L-antikapsinden oluşan basit bir dipeptit (125kDa) antibiyotik olan Basilisin bunlardan biridir. Belirli Bacillus suşları tarafından sentezlenebilen Basilisin çok sayıda bakteri türüne ve bazı mantarlara karşı antimikrobiyal etki göstermektedir. Basilisinin antimikrobiyal özelleği L-antikapsin bakiyesi tarafından gerçekleştirilir. Yakın zamanda yapılan çalışmalarla Basilisinin biyosentezinden sorumlu olan mekanizmanın polisistronik operon bacABCDE (eski ismi ywfBCDEG) ve monosistronik ywhH olduğu ortaya çıkarılmıştır. Yapılan çalışmlarda elde edilelen sonuçlara göre, BacA, BacB, YwfG ve YwfH proteinleri antikapsin üretiminde görev aldığı, BacD proteinin L-antikapsin ve L-alaninin ligasyonu için gerekli olduğu ve BacE geni ürünü ise Basilisinin olumsuz etkilerinden konak hücreyi korumak için immünite oluşturan hücre transport proteini olduğu tespit edilmiştir. Bacillus subtilis’te basilisin sentezinin global hücre yoğunluğu sinyal kontrol (Quorum Sensing) ağı tarafından düzenlendiği keşfedilmiştir. Bunun yanında Basilisin biyosentezini doğrudan kontrol eden başka regülatör proteinlerde vardır. Önceden, basilisin biyosentezi, ComQ/ComX, PhrC (CSF), ComP/ComA’ nın Spo0K (Opp)’ye bağlı bir biçimde hücre yoğunluğu sinyali döngüsünün kontrolü altında gerçekleştiği gösterilmiştir. Yapılan çalışmalarda Bacillus subtilis’te sporlama başlangıcında önemli rol oyanayan global regülatör SpoOA basilisin biyosentezini pozitif yönde regüle ederken , global geçiş düzenleyicileri ArbB ve CodY proteinleri tarafından negatif yönde regüle edildiği ortaya çıkarılmıştır. Aynı zamanda basilisin biyosentezinin besinsel yönden fakir bir ortamda bakterilerin kıtlık ortamlarına adaptasyonunu sağlayan ve dört-beş fosforlu guanin nukleotid (ppGpp) moleküllerinin kontrolununu içeren “stringent”global kontrol sisteminin etkisi altında olduğuda gösterilmiştir. Son çalışmalarda yvfI (yeni adıyla lutR) geninin basilisin biyosentezi için gerekli olduğu tespit edilmiştir. Yapılan genomik ve proteomik çalışmalar sonucu LutR proteinin GntR protein ailesinin alt grubu olan FadR-benzeri proteinler ile yüksek homoloji gösterdiği ortaya çıkarılmıştır. FadR-benzeri proteinler birçok yolağın regülasyonunda görev alırlar, örneğin, amino asit metabolizması, L-laktat ve şeker kullanımı, yağ asiti transportu ve yıkımı gibi. Son yapılan çalışmalarla YvfI’ın yvfV-yvfW-yvbY genlerinden oluşan lutABC operonunun kontrolünü negatif yönde üstlendiği görülmüştür. Bir diğer geçiş fazı düzenleyicisi olan SinR proteini tetramerik yapıdadır. DNA’ya bağlanma özelliğine sahip SinR proteini 14-kDa büyüklüğündedir ve sinR geni tarafından kodlanır. SinI, SlrA ve SlrR proteini SinR fonksiyonlarına zıt özellik gösterir ve aynı zamanda SinR’ın DNA’ya bağlanmasına engel olur. Bu dört proteinin oluşturduğu mekanizma SinR proteinin genleri veya operonları baskılayıp baskılamayacağını belirler. Global düzenleyici olarak tanımlanan SinR proteini birden fazla süreçte düzenleyici olarak görev alır (spor oluşturma, hareket, kompetens, biyofilm oluşturma, hücre dışı enzim üretimi gibi). Sporulasyon ve biyofilm sentezinde görevli genlerin genlerin promotör kısımlarına bağlanarak regülasyonu gerçekleştirmektedir. Bunun yanında ComK (kompetans faktörü) proteinin negatif kontrolünden sorumlu Rok protinin sentesizini baskılar. Geçmiş çalışmalarda lutABC operonunun SinR ve LutR protein ikilisinin direk olarak negatif kontrolünde olduğu ortaya çıkarılmıştır ve daha sonra yapılan deneylerde LutR proteinin kontolünü yaptığı genlerin aynı zamanda SinR regülatör proteinin direk etkisi altında olduğu gösterilmiştir. Bu sonuçlardan yola çıkarak SinR ve LutR proteinlerinin daha önce LutR’ın pozitif yönde regüle ettiği belirlenen Basilisin biyosentezinin regülasyonunda ortak çalışıp çalışmadığını araştırmak istedik. Bu çalışmada SinR ve LutR proteinlerinin bacABCDEywfG operonu ekpresyonuna etkisi tayin edilmiş ve bu amaç doğrultusunda sinR ve lutR genleri insertional inaktivasyon yöntemi ile silinmiş bacA lokusunda lacZ füzyonu taşıyan double mutant OGU1SRLR(lutR::Tn10::spc ΔsinR::cm bacA::lacZ::erm) elde edilmiştir. Bir sonraki adımda ise, OGU1 (bacA::lacZ::erm), OGU1LR (lutR::Tn10::spc bacA::lacZ::erm), OGU1SR (ΔsinR::cm bacA::lacZ::erm) ve OGU1SRLR (lutR::Tn10::spc ΔsinR::cm bacA::lacZ::erm) PA besi yerinde çoğaltılmış ve bac promotoruna bağlı β-galaktosidaz aktiviteleri belirlenmiştir. Bacillus subtilis PY79 suşunda basilisin üretimiyle ilgili genleri açığa çıkarmak için yapılan Tn10 mutagenesis çalışmaları sonucunda, GntR tipte transkripsiyonel düzenleyici kodladığı belirtilen benzeyen lutR geninin basilisin biyosenteziyle ilgisi olduğu bulunmuştur. Bununla birlikte, LutR ve SinR proteinlerinin düzenledikleri genlerin bir çoğunun ortak olması nedeniyle basilisin üretimin düzenlenmesinde birlikte görev alabilecekleri düşünmekteyiz. Bacillus subtilis’te SinR ve LutR transkripsiyonel faktörleri için varsayılan bağlanma bölgelerinin araştırılması amacıyla bacABCDEywfG operonunda bulunan bac operonununpromotör (PbacA)kısmı ile çalışılmıştır. Bu bağlamda SinR ve LutR proteinleri bac promoter DNA’sına bağlanma eğilimi “Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA)”deneyi ile test edilmiştir. Bu amaçla 382 bç DNA parçasını içeren bacA promotör bölgesi, saflaştırılmış C-ucu His6 kuyruklu SinR ve LutR proteinlerinin çeşitli konsantrasyonları ile inkübe edilmiştir. Bunu dışında SinR-LutR ‘ın eş zamanlı mı veya yarışmacı olarak mı PbacA’ne bağlandığını belirmek amacıyla iki düzenleyici proteinin varlığında “Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA)” yöntemi tekrarlanmıştır.

Bacillus subtilis is a a rod-shaped nonpathogenic gram positive bacterium. Its genome has been completely sequenced with size of approximately 4,2 Mbp and about 4,100 different encoding genes. The ability of adaptation to extreme conditions is one of the numerous features of Bacillus subtilis. it can synthesize various antibiotics and degradative enzymes, undergo chemotaxis, produce spores, develop competence and biofilm. Bacilysin is a simple dipeptide antibiotic which is produced and secreted by some Bacillus subtilis species. Its basic structure is composed of L-alanine at its N-terminus and an unusual aminoacid L-anticapsin at its C-terminus. The ywfBCDEFG operon and monosistronic ywfH gene of B. Subtilis have been demonstrated to have biosynthetic core function on bacilysin production and it is renamed as bacABCDEywfG. Beforehand it was revealed that biosynthesis of bacilysin is under the positive control of quorum sensing global regulatory circuit through the action of ComQ/ComX, PhrC(CSF), ComP/ComA in a Spo0K (opp)-dependent manner. Furthermore, bacilysin production is also positively regulated by global regulatory factor Spo0A and negatively regulated by transition state regulators, CodY and AbrB. Recently, the effects of novel protein LutR on the expression of bac operon and its interaction with the promoter region of bac operon were investigated. It was shown that LutR is essential for bacilysin production. In Bacillus subtilis, LutR is a GntR type transcriptional factor which contains a FadR C-terminal ligand binding (FCD) domain which is very common among GntR family of proteins and a HXH type DNA binding domain. Also, LutR is known to regulate yvfV-yvfW-yvbY (lutABC) operon that has a role in lactate utilization in Bacillus subtilis. Additionally, several regulons function differently by coordinating these proteins that act as regulators. SinR repressor is a part of a sin group (sporulation inhibition) proteins in Bacillus subtilis. SinR which is a master regulator, is a tetrameric repressor protein that binds to the promoter of genes that is essential for entry into sporulation and prevent their transcription. SinR is controlled by its antagonists, SinI, SlrA, SlrR. The interaction of these four proteins generate a switch, which decide whether SinR is able to repress genes or operons. It also negatively regulates the biofilm genes by acting as a respressor of tapA-sipW-tasA and eps operons. Several genes and operons are under the control of SinR, one of them, the lutABC operon. Recently it was shown that lutABC operon is also under the negative control of LutR. Besides, the lutABC operon, the SinR direct targets, tapA and aprE operons, were also found under the direct control of LutR. In the present study, dual effect of SinR and LutR on the expression of bacABCDEywfG operon was investigated. To analyse the effect of sinR and lutR double mutations on the expression of bacA profile, lacZ fusion analysis was used and for that purpose sinR deleted mutant (ΔsinR::cm) was subjected to chromosomal DNA isolation. Subsequently, a Bacillus strain carrying lacZ fussion at bacA loci and lutR mutation (lutR::Tn10::spc bacA::lacZ::erm) named as OGU1RL was transformed by the chromosomal DNA of sinR mutant strain. By this way, sinR was distrupted in lutR::Tn10::spc bacA::lacZ::erm mutant strain thus sinR-lutR double mutant strain was obtained. Furthermore, disruption of sinR and lutR genes was also verified by PCR using specific primers and thus contructed lutR::Tn10::spc ΔsinR::cm bacA::lacZ::erm mutant strain was named as OGU1SRLR. As a following step OGU1(bacA::lacZ::erm), OGU1LR (lutR::Tn10::spc bacA::lacZ::erm), OGU1SR(ΔsinR::cm bacA::lacZ::erm) and OGU1SRLR (lutR::Tn10::spc ΔsinR::cm bacA::lacZ::erm) were grown in PA medium and bac promoter-directed a β-galactosidase activities were measured. In addition to that, to identify whether SinR and LutR are able to bind to promoter region of bacABCDEywfG operon simultaneously or compete for binding, the gel retardation assays were employed in the presence of both regulator proteins in which the fixed amount of one of them was mixed with various concentrations.